4种海藻多糖对鲫鱼生长免疫影响的探究

耿中雷，杨亚云，蔡春尔,2，何培民,2

( 1.上海海洋大学 海洋生态与环境学院，上海 201306； 2.江苏高校协同创新中心，江苏 连云港 222005 )

4种海藻多糖对鲫鱼生长免疫影响的探究

耿中雷1，杨亚云1，蔡春尔1,2，何培民1,2

( 1.上海海洋大学 海洋生态与环境学院，上海 201306； 2.江苏高校协同创新中心，江苏 连云港 222005 )

为研究4种海藻多糖对鲫鱼生长和免疫的影响，将鲫鱼[(50±5) g]暂养2 d，随机分为普通饲料组、浒苔组、条斑紫菜组、铜藻组、坛紫菜组5组，每组4个重复，每个平行10尾，准确记录体质量。养殖60 d后，注射菌体密度为107cfu/mL嗜水气单胞菌，24 h后称取鱼的体质量，解剖脾脏称量质量，并取鱼血测定碱性磷酸酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、总蛋白、球蛋白活性。试验结果显示，浒苔组、条斑紫菜组、铜藻组鱼的质量增加率相比普通饲料组有所提高，其中浒苔组效果最好，质量增加率为47.50%。浒苔组、条斑紫菜组、铜藻组、坛紫菜组鲫鱼的脾体比均有所增加，且浒苔组和条斑紫菜组较好，脾体比增加量分别为23.76%和27.73%，4组培养基中菌落数较普通饲料组有所减少。血液生化检测结果，浒苔组的总蛋白和球蛋白含量均高于普通饲料组。由结果数据分析可以看出，4种海藻多糖在一定程度上可促进鲫鱼生长并能提高其抗病能力。

海藻多糖；鲫鱼；体质量；免疫力

海洋蕴涵着丰富的海藻资源，海藻中多糖的含量达到干质量的50%以上[1]。各种多糖在对动物体的免疫调节试验中显示高活性和低毒性[2-3]。褐藻糖胶、海带(Saccharinajaponica)多糖、海藻酸和浒苔(Enteromorpha)多糖都具有抗氧化性质[5-6]。此外，灌胃试验证明，褐藻多糖硫酸酯具有抗凝血作用[7]。

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)为淡水生革兰氏阴性菌，在一定条件下对水产动物、畜禽和人类均有致病性[8-10]。可引起鱼体出血性败血症，导致鱼鳍和鱼尾腐烂，在人体的肠道和伤口也可引起感染[10-14]。现已知嗜水气单胞菌可产生外毒素、胞外蛋白酶、S蛋白、菌毛、外膜蛋白、脂多糖等多种毒力因子，部分胞外蛋白酶也具有直接致病性[15]。

传统的广谱抗生素不仅增加抗药性，还会杀死体内有益微生物[16]。免疫多糖既能提高动物体自身免疫力，在避免这些问题的同时，还能抑制部分疾病的发生。本试验探究4种海藻多糖对鲫鱼(Carassiusauratus)生长和免疫的影响，为饲料中添加多糖对鲫鱼生长和免疫功效影响提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 材料与动物

试验鲫鱼由上海海洋大学青浦鱼类育种试验站提供，规格为(50±5) g/尾。

嗜水气单胞菌ATCC7966由上海海洋大学国家水生生物病原库赠送。

碱性磷酸酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、总蛋白、球蛋白试剂盒，购买于迈瑞医疗国际有限公司

浒苔(E.prolifera)采自江苏大丰海区，条斑紫菜(Porphyrayezoensis)采自江苏如东海区，铜藻(Sargassumhorneri)采自浙江枸杞岛，坛紫菜(P.haitannesis)采自福建福鼎海区。

1.2 仪器与设备

T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；BS-200全自动生化分析仪(迈瑞医疗国际有限公司)；低温恒温培养箱(三洋设备特约维修中心)；SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司)。

1.3 多糖制备

多糖的提取参考文献[17]，洗净烘干后的藻体用乙醇浸泡后，用筛绢过滤，所得藻体自然晾干，加蒸馏水至物料比为1∶40 (g/mL)浸泡，捣碎后，95 ℃恒温，冷却后用筛绢过滤和离心后，将清液添加乙醇至终体积分数为80%，静置过夜，离心取沉淀，冻干得粗多糖。

1.4 饲料制备

试验使用的鲫鱼普通饲料组即对照组配方见表1。粗蛋白含量31.01%，粗脂肪含量6.04%，试验组各组合添加物含量4%。各种成分充分混合，再加适量的水，采用冷挤压技术，切成颗粒，空气干燥，常温保存。

表1 饲料配方 g/kg

1.5 饲养试验设计

养殖设备为80 L的循环水养殖玻璃鱼缸，随机选取鲫鱼220尾，暂养7 d后置于干净的养殖水体中空腹2 d，使之充分排便和适应养殖环境，暂养期间每日喂食对照组饲料两次(09:00和18:00)，总投喂量为体质量的10%。暂养结束后挑选健康鲫鱼，分5个组养殖，每组4个平行，每个平行10尾。禁食1 d后，其中4个试验组分别喂食含浒苔多糖、条斑紫菜多糖、坛紫菜多糖和铜藻多糖的饲料，阴性对照组喂食对照组饲料。养殖周期为60 d[18]。养殖期间采用24 h连续充气，自然周期采光。

1.6 免疫力检测

测量试验前后鲫鱼体质量变化，时间点为鲫鱼暂养两天后刚分组时，及喂养60 d后，计算平均值。鲫鱼喂养60 d后，每缸随机选取3尾，解剖，完全剥离获取脾脏，用吸水纸吸净表面水分后，准确称量质量，分别记录对照组的脾脏平均质量和试验组脾脏平均质量，从而计算鲫鱼的脾体比。

1.7 抗菌试验

鲫鱼喂养60 d后，每缸随机选取6尾，腹腔注射嗜水气单胞菌(菌体密度约为106～107cfu/mL)0.15 mL。养殖24 h后每缸随机选取3尾，尾鳍抽血，涂含细菌培养基的平皿，30 ℃恒温培养24 h后，观察并记录菌落数。剩余鲫鱼养殖1周后尾鳍抽血，静止过夜，取上清液，购试剂盒，采用BS-200全自动生化分析仪(迈瑞医疗国际有限公司)，测定碱性磷酸酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、总蛋白和球蛋白含量。

1.8 数据处理

质量增加率/%=(m2-m1)/m2×100%

脾体比/%=m3/m×100%

式中，m1为鲫鱼初始体质量，m2为鲫鱼终末体质量，m3为鲫鱼的脾脏质量，m为鲫鱼体质量。

试验数据均用平均值±标准差表示，用SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析，进行多重比较，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 不同试验组鲫鱼生长

养殖60 d后，各组鲫鱼体质量均有所增加，坛紫菜组的终体质量与其他组相比差异显著(P<0.05)(表2)。与对照组相比，浒苔多糖、条斑紫菜多糖和铜藻多糖组对鲫鱼的生长均有一定的促进作用(P>0.05)，其中浒苔多糖对鲫鱼的生长促进作用最佳，质量增加率比普通饲料组提高了47.50%(P<0.05)(图1)。

表2 鲫鱼体质量变化 g

注：A: 对照组；B: 浒苔组；C: 条斑紫菜组；D: 铜藻组；E: 坛紫菜组. 同行数据上标不同字母表示平均值间差异显著(P<0.05).

图1 不同组鲫鱼质量增加率A:对照组；B: 浒苔组；C: 条斑紫菜组；D: 铜藻组；E: 坛紫菜组. 图中不同字母表示平均值间差异显著(P<0.05)，下同.

2.2 脾脏指数变化

与对照组相比，4个试验组脾脏质量指数均有增加，但差异不显著(P>0.05)。

图2 脾脏所占体质量比例

2.3 免疫指标变化

浒苔多糖组碱性磷酸酶、总蛋白、球蛋白含量较对照组升高(P<0.05)，其余组明显下降(P<0.05)，4个试验组中的谷草转氨酶、谷丙转氨酶含量低于阴性对照组(P<0.05)(图3)。

图3 碱性磷酸酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、总蛋白、球蛋白含量

2.4 浒苔及4种试验藻体多糖对机体噬菌作用的抑促效果

鲫鱼血涂板培养24 h后，浒苔组、铜藻组及坛紫菜组较对照组培养基上生长的菌落数明显减少，且以浒苔多糖和铜藻多糖组最为显著(P<0.05)(图4)。

图4 5组培养基上的菌落数

3 讨 论

3.1 海藻多糖对鲫鱼体质量的影响

张银花等[19]在鲫鱼的饲料中添加0.15%黄芪多糖能够促进鲫鱼体质量增长。本研究浒苔组、条斑紫菜组、铜藻组对鲫鱼体质量的增加有着明显的促进作用，其中浒苔组的效果最为显著，比普通饲料组提高了47.50%。

3.2 海藻多糖对鲫鱼脾体比的影响

机体免疫能力的加强可提高机体对不良环境的适应能力和对细菌病毒的抵抗能力。脾脏作为机体的主要免疫器官之一，脾体比增加，在一定程度上说明机体的免疫能力有所增强，在喂养异育银鲫的饲料中添加一定量的黄芪多糖，能够提高试验鱼脾脏指数[20]。本试验在饲料中添加4种海藻多糖，发现4个试验组的脾脏所占比相对普通饲料组均有所增加，其中浒苔组和条斑紫菜组效果最为显著，增加率分别能够达到23.76%和27.73%，这一试验结果也与Wei等[21-22]的研究结果相一致，表明这4种海藻多糖均能够刺激机体免疫器官的发育，从而达到加强机体免疫力的效果。

3.3 海藻多糖对鲫鱼免疫指标的影响

海藻多糖具有免疫调节活性，可增强机体的免疫功能。碱性磷酸酶是高等动物体内巨噬细胞溶酶体的标志酶，在体内直接参与磷酸基团的转移和代谢，加速物质的摄取和转移，溶酶体的水解作用是机体攻击异物的主要机制之一[23]。谷草转氨酶和谷丙转氨酶是肝脏受损的灵敏指标[24]，二者活性的降低说明4组饲料中的添加的多糖均对肝脏起到了保护作用。总蛋白的升高，主要成分是球蛋白的升高，体内有细菌或病毒存在，这些病原体产生的抗原，都可以刺激淋巴细胞产生一些球蛋白抗体。徐贤柱等[25]采用杜仲叶多糖对小鼠进行灌胃，发现多糖可以显著提高小鼠血清中免疫球蛋白G和免疫球蛋白M的含量。Matsumoto等[26]从银柴胡根中提取出1种果胶多糖并研究了其可以促进B淋巴细胞周期蛋白表达。因此球蛋白的含量直接影响着机体对细菌或病毒的清除能力。本试验表明，浒苔组可以提高碱性磷酸酶和血清中球蛋白总含量，从而达到提高鲫鱼抵抗病毒的能力。血清中细菌数量的减少说明机体的抗病毒能力得到提高。血清中细菌的数量也反映出机体对病毒的清除能力，也是自身抗病毒能力的直接体现，浒苔组和铜藻组有效地抑制病毒在体内生长，提高了机体的抗病毒能力。

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EffectsofDietarySupplementationofFourAlgaPolysaccharidesonGrowthandDiseaseResistanceinCrucianCarpCarassiusauratus

GENG Zhonglei1, YANG Yayun1, CAI Chuner1,2, HE Peimin1,2

( 1. College of Marine Ecology and Environment, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China； 2. Collaborative Innovation Centre of Colleges in Jiangsu Province, Lianyungang 222005, China )

Crucian carpCarassiusauratuswere randomly divided into four groups and fed diet containing polysaccharides from algaeEnteromorphaprolifera,Porphyrayezoensis,SargassumhorneriandP.haitanensisto research effects of four alga polysaccharides on growth and immunity of the fish. After 60 day culture, the body weight was recorded again, and the speen in some samples was also weighted after dissection. The rest fish were injected withAeromonashydrophilaat 107cfu/mL and reared for another one day. The bacterial number and activities of alkaline phosphatase, aspartate aminotransferase, and alanine aminotransferase, and total protein and globulin levels were analyzed in blood. The results showed that there were higher weight gain rates in the fish fed the diets containingE.prolifera,P.yezoensisandS.hornerithan that in control group, with the maximum of 47.5% inE.proliferagroup. The spleen—somatic index in all groups were elevated, especially in theE.prolifera(23.8%) andP.yezoensis(27.7%) groups. On the contrary, the number ofA.hydrophilain blood was lower in all groups than that in control group. The biochemical test indicated that the content of total protein and globulin in blood of the fish inE.proliferagroup were to some extent higher than that in other groups.It is concluded that all the four kinds of seaweed polysaccharides have potential to promote the growth and immunity of crucian carp.

alga polysaccharide;Carassiusauratus; weight gain rate; spleen somatic index

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.010

S965.117

A

1003-1111(2017)06-0753-05

2016-09-13；

2017-03-13.

国家科技支撑计划项目(2012BAC07B03)；国家重点研发计划项目(2016YFC1402105)；国家自然科学基金资助项目(41576163)；上海海洋大学博士启动基金资助项目(A2-0203-00-100322).

耿中雷(1990—)，男，硕士研究生；研究方向：海洋生物活性物质制备与应用.E-mail:654384357@qq.com. 通讯作者：何培民(1959—)，男，教授；研究方向：海藻资源化利用、藻类分子技术. E-mail:pmhe@shou.edu.cn.