高通量测序分析酵母培养物对肉仔鸡盲肠菌群的影响

孙 吉吉，甄玉国 ，赵 巍 ，赵小丽 ，王 涛 ，秦贵信

（1.吉林农业大学生命科学学院，吉林长春 130118；2. 长春博瑞饲料集团有限公司技术中心，吉林长春 130118；3. 吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130118）

高通量测序分析酵母培养物对肉仔鸡盲肠菌群的影响

孙 吉吉1,2，甄玉国2,3，赵 巍2,3，赵小丽2，王 涛2,3，秦贵信3*

（1.吉林农业大学生命科学学院，吉林长春 130118；2. 长春博瑞饲料集团有限公司技术中心，吉林长春 130118；3. 吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130118）

本实验旨在探讨酵母培养物对肉仔鸡盲肠菌群的影响。选取336羽健康且体重相近的1 日龄AA肉仔鸡，随机分7个处理组，每组6个重复，每个重复8只。A组（对照组）饲喂基础日粮，B、C、D、E、F组分别在基础日粮中添加发酵时间为12、24、36、48、60 h的酵母培养物，G组在基础日粮中添加“达农威益康 V XP”酵母培养物产品。预试期7 d，正试期42 d。采用Illumina Miseq高通量测序技术对肉仔鸡盲肠内容物菌群分析。结果表明：与A组（对照组）相比，C、D组肉仔鸡的平均日增重显著提高（P<0.05），耗料增重比显著降低（P<0.05）；而D组肉仔鸡盲肠菌群物种多样性最高，C组最低；在 Phylum（门）的水平上，各组中的Firmicutes （厚壁菌门）比例最高，而C组样品中Verrucomicrobia（疣微菌门）含量较其他组显著增加；在Genus（属）的水平上，7组样品的盲肠内容物中以Bacteroides、Faecalibacterium、Lactobacillus、Blautia等菌属为主。综上，不同发酵时间的酵母培养物对肠道菌群有显著影响，可通过调整发酵时间来控制其代谢产物，进而影响动物的生产性能。

酵母培养物；盲肠菌群；高通量测序

动物肠道健康是维持其正常生长、获取优质动物性产品的首要因素。动物肠道内微生物数量庞大，功能复杂，介导或影响宿主营养物质代谢及生物活性成分和免疫等生理过程[1]。为肠道微生物提供活菌、一种或几种益生元无法应对应激环境中多变的肠道细菌，因此肠道安全需要全面均衡的营养底物来维持其动态平衡。

酵母培养物通过向动物消化道微生物提供“全价”的营养底物，促进代谢平衡，有效缓解因各类应激引发的消化功能障碍，能够保障肠道安全。近年来，酵母培养物逐步成为替代抗生素的微生态制剂之一[2]。本试验利用目前研究肠道微生物的前沿技术——Illumina Miseq高通量测序技术，分析不同发酵时间产生的酵母培养物对肉仔鸡盲肠菌群的影响，并初步探讨酵母培养物的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物及材料 AA肉仔鸡购自吉林德详公司；酿酒酵母培养物为吉林农业大学吉农博瑞研发中心实验室自主筛选配制的糖蜜培养基培养的酿酒酵母培养物，其主要成分包括酵母细胞外代谢产物、经发酵后变异的培养基、自溶后的酵母细胞壁和酵母细胞内容物等。达农威益康V XP（达农威中国有限公司）；免疫指标ELISA试剂盒（上海研生生物科技有限公司）。

1.2 试验设计 试验采用完全随机分组设计，将购自长春德详公司的1日龄AA肉仔鸡336只，随机分为7个处理组，每组6个重复，每个重复8只鸡，且各处理组之间肉仔鸡的体重差异不显著（P>0.05）。日粮参照NRC（1994）和AA 肉鸡饲养标准配制，各阶段对照组和处理组饲粮营养水平保持一致，且不含药物成分。试验预试7 d，正试期42 d。A组为对照组，开始B、C、D、E、F组从第7天开始，分别在基础日粮中添加发酵时间为12、24、36、48、60 h的酵母培养物，G组在基础日粮中添加“达农威益康 V XP”酵母培养物产品，各处理组添加量为0.192%（发酵液干物质质量/饲料质量）。试验日粮配方见及营养成分见表1。

表1 基础日粮组成及营养成分（风干基础)

1.3 方法

1.3.1 样品采集 肉仔鸡以每个重复为单位，每天记录投料量、剩料量和损失量，分别于21 d和42 d的前1 d晚上禁食12 h，但不禁水，第2天08:00对每个重复的肉仔鸡进行称重，并记录各重复的采食量，计算平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）和耗料增重比（F/G）。收集屠宰42 d各组肉仔鸡盲肠内容物，每组 0.5 g。置于干燥的灭菌试管中，-40℃的冰箱中保存。

1.3.2 DNA 提取和测序 采用肠道内容物基因组DNA 提取试剂盒提取各组肉仔鸡盲肠内容物中微生物的总DNA，且每组高通量测序样本数为6个。所提取的 DNA 于-40℃的冰箱中保存，干冰条件下送往上海生工生物工程股份有限公司，对样品进行 PCR 扩增及测序。按指定测序区域，合成带有barcode 的特异引物：515F（5'-GTGCCAGCMGCCG CGGTAA -3'）和 806R（5'-GGACTACHVGGGTWT CTAAT-3'），对样本的16S rRNA基因 V4 区域进行扩增。

1.3.3 生物信息分析 PCR 产物采用 Miseq 高通量测序平台进行高通量测序。测序得到的 PE reads 首先使用FLSAH进行拼接，并对序列质量进行质控，在去除低质量碱基及接头污染序列等操作过程后完成数据过滤，得到可供后续分析的高质量目标序列。生物信息学操作使用QIIME[3]、Mothur[4]、R[5]等软件对样本进行Alpha多样性分析、Beta多样性分析以及菌群的结构差异分析。其中，Alpha多样性是对单个样品中物种多样性的分析，包括ACE值、Chaol值、Shannon指数等。Chaol值和ACE值是根据所测得的OTU数量预测样品中微生物的种类，Shannon指数是一个多样性指数，Shannon指数越大，则表示该样品中的物种越丰富。Beta多样性分析是研究度量时空尺度上物种组成的变化情况。Beta分析有的聚合PCoA、PCA或NMDS等。

1.4 统计分析 采用Excel整理与统计数据，结果以平均值±标准差表示，用SPSS19.0软件进行比较，多重比较用Duncan's 法，用ANOVA过程进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同发酵时间的酵母培养物对肉鸡生长性能的影响 由表2可知，在整个试验期，C、D 组的ADG和F/G显著高于对照组（P<0.05）；7～42 d，各试验组的ADFI与对照组相比变化不显著。

2.2 菌群Alpha多样性分析 OTU 数量可以表示样品物种的丰度[6]。稀释性曲线用于判断测序数量不同的样本物种的丰富度及样本的取样大小的合理性。从图1可以看出，饲喂不同发酵时间的酵母培养物对肉仔鸡肠道菌群产生了影响，说明建模成功。随着所测序列数量的增加，各组样品的 OTU 数量也随之增大，但增大的幅度呈递减趋势，说明测序质量较好，具有一定的深度。

在所有样品中，D组 OTU 数量最多，C组最少，表明D组菌群多样性较高，各处理组间的菌群丰度存在差异不大。Simpson 值越低表示群落多样性高，对照组的 Simpson 值在样品中最小，为 0.91，其余样品的 Simpson 值在0.94～0.97，样品间的 Simpson值差异不显著。ACE、Chao1、Shannon 指数是对菌群丰度进行的评估，值越大表明群落多样性越高。其中，D组样品中菌群多样性指数最高（ACE值为1187.24，Chaol值为 1183.84），C组最低（ACE值 为 867.51，Chaol值 为 840.33）。D组 的 ACE值和Chaol值显著高于C组（P<0.05）。同时，Alpha 多样性分析也表明，与对照组相比，A至F组，随着添加发酵时间增加的酵母培养物，肉仔鸡肠道菌群的多样性呈先下降再上升的趋势，节点在D组。并且肉仔鸡肠道菌群除C组外，A、B、D、E、F组菌群丰度均高于G组。 7组样品中D、F组的 Shannon 值较大，除C组外，其余各组 Shannon值均高于对照组，说明饲喂发酵时间为36 h的酵母培养物时，盲肠微生物种类最为丰富。以上数据表明，饲喂不同发酵时间的酵母培养物对肉仔鸡肠道菌群多样性有一定影响。

表 2 酵母培养物对肉仔鸡生长性能的影响

图 1 各组盲肠内容物样品菌群稀疏曲线

2.3 菌群Beta多样性分析 根据测序结果绘制PCA，进一步从宏观角度了解饲喂不同发酵时间的酵母培养物各组鸡肠道菌群结构差异。由图2可知，相对于对照组，试验组的菌群结构组成均发生一定变化。其中，C组与其他试验组相比，样本的距离相对较远，其菌群结构组成变化较大。说明在饲喂不同发酵时间的酵母培养物后，试验组与对照组样本之间D的菌群结构产生了差异。

图2 肉仔鸡肠道菌群结构PCA

2.4 菌群结构分析 根据分类学在门及属水平上对样品中群落结构进行菌群种类和丰度分析。如图3所示，7组样品的菌群组成在 Phylum（门）的水平上，肉仔鸡的盲肠微生物以Firmicutes（厚壁菌门）（0.55±0.12）、Bacteroidetes（拟杆菌门）（0.37±0.21）、Verrucomicrobia（ 疣 微 菌 门 ）（0.033±0.023）等3个菌门为主。 其中，C组样品中疣微菌门含量较其他组显著增加，占盲肠内容物菌群的50%以上，各组中的厚壁菌门在总菌群中比例最高。而Tenericutes（无壁菌类）在各组中含量较低，但与其他组相比，E组中无壁菌类所占比例相对较大。而只在BEG组中检测出含量较低的Actinobateria（放线菌门）。在整个盲肠菌群中，在D组和G组中检测出 Cyanobacteria（蓝细菌）、Deferribacteres（脱铁杆菌门），是这2组特有的菌群。盲肠微生物的优势菌门相对丰度比较结果均为厚壁菌门>拟杆菌门>疣微菌门>变形菌门 。

由图4可知 , 在Genus（属）的水平上，7组样品的盲肠内容物中均包含的优势菌属为Bacteroides、Faecalibacterium、Lctobacillus、Blautia等属微生物，比例均在20%左右，而这些菌属均与维持肠道平衡有关[7]。其中C组中Akkermansia“减肥细菌”显著高于其他组，而 F组中含量最少。与F组相比，C组Lactobacillus（乳酸杆菌属）低于F组，可见酵母培养物有助于肉仔鸡肠道中Lactobacillus属的增加。

图 3 样品在门水平上的相对丰度

3 讨 论

图 4 样品在属水平上的相对丰度

酵母培养物是经过有氧环境下的酵母细胞扩繁和厌氧环境下酵母细胞发酵2个不同的工艺控制过程而形成的微生态制品，主要包括酵母细胞外代谢产物、经过发酵后变异的培养基和少量已无活性的酵母细胞。在生产过程中，所采用培养基的成分和发酵过程中对肽、酯和有机酸等因素的控制直接导致了酵母细胞发酵时产生的代谢产物成分的不同[8]。本试验采用的酵母培养物是由试验室自主筛选配制的糖蜜培养基培养，选用酿酒酵母种经过有氧酵母细胞扩繁12 h，再厌氧发酵48 h而得到。而目前“达农威益康 V XP”酵母培养物产品也是选用酿酒酵母，通过特配的液体培养液和谷物培养基发酵而成。

在本试验条件下，与对照组相比，在基础日粮中添加不同发酵时间的酿酒酵母培养物可以改善肉仔鸡的生长性能，与多数研究结果基本一致[9-10]。其中添加发酵24 h（C组）和36 h（D组）的酵母培养物组提高效果最明显，且优于G组。可能与发酵24 h和36 h的酵母培养物中含有甘露寡糖、蛋白质螯合物、维生素、酶类、增味物质等一些协同因子有关[10]。而添加不同发酵时间的酵母培养物对肉仔鸡盲肠菌群的影响也不尽相同。肠道菌群多样性分析表明，酵母培养物组肉仔鸡盲肠菌群多样性高于对照组，说明酵母培养物影响了肉仔鸡肠道微生态的动态平衡，且增加了盲肠菌群的多样性，菌群多样性的变化与肉仔鸡的生长性能存在一定的关联。

肠道微生物种类繁多，在门的水平上可分为 6大类，即厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门、梭杆菌门和疣微菌门[11-12]，其中90%以上由厚壁菌门和拟杆菌门构成。本研究中，在门水平上，肉仔鸡肠道的优势菌群主要包含厚壁菌门、拟杆菌门，这与相关文献的研究结果相似[12]。与空白对照组和阳性对照组相比，C、D组对肉仔鸡的生长性能呈现最佳正效应影响。而F组的生长性能最低，C组的菌群多样性低于F组。其原因是发酵24 h的酵母培养物中富含的益生菌不断增加，增加了乳酸菌等有益菌的有效浓度，选择性地抑制有害菌繁殖，促进胃肠道有益菌群增殖，从而改善了机体微生态结构，提高动物对营养物质的利用率[13]，提高了饲料转化率，对肉仔鸡生产性能产生了一定正向影响。这也可能与酵母培养物中的寡糖有关，寡糖具有促进有益菌如双歧杆菌、乳酸杆菌等增殖作用[14]。C组样品中疣微菌门含量较其他组显著增加，占盲肠内容物菌群的50%以上，而F组中疣微菌门含量显著低于C组。厚壁菌门在各组样品中的比例变化不明显，可见不同发酵时间酵母培养物中的成分对厚壁菌门影响不大。在属水平上，Bacteroides、Faecalibacterium、Lactobacillus、Blautia比例较高。研究进一步发现，Blautia、Faecalibacterium、Bacteroides等3个具有产短链脂肪酸能力的细菌属存在于所有的动物个体中，是肠道菌群中的有益菌， 在维持动物健康方面具有至关重要的作用[16]。这也说明饲喂酵母培养物可在一定程度上改善菌群结构。而添加发酵24 h的酵母培养物组中AKK（Akkermansia） 菌属显著高于其他各组，AKK作为益生元，能增厚肠道黏液层，改善代谢，改变脂肪的处理方式，它能特异性地刺激某一种或几种对健康有益的细菌生长，进而提高动物的生长性能[15-16,18]。

综上所述，饲粮中添加酵母培养物可促进机体的生长发育，提高有益菌群的数量，可能是其自身及发酵代谢产物中某些成分在发挥作用，从而改善和维持肠道菌群区系平衡。酵母培养物中的营养代谢物（如氨基酸、糖类、维生素、有机酸等）能够为胃肠道内的菌群微生物提供生长代谢底物，从而促进微生物的新陈代谢，并调整菌群结构，提高有益菌群繁殖能力[17,19-20]，但其有效成分及作用机制仍有待验证。

4 结 论

日粮中添加不同发酵时间的酵母培养物提高了肉仔鸡的生长性能，其中添加发酵24 h（C组）和36 h（D组）的酵母培养物组提高效果最显著。酵母培养物能够提高肉仔鸡肠道菌群的丰度，在一定程度上可促进有益菌群数量的增加。摄入适量酵母培养物有利于调节肠道菌群的平衡，且添加发酵24 h的酵母培养物组中AKK菌属显著高于其他各组，其作为益生元，能够改善代谢，促进有益菌生长。

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Effect of Different Fermentation Duration of Yeast (Saccharomyces cerevisiae) Culture on the Intestinal Microbiota by Miseq High-throughput Sequencing

SUN Zhe1,2, ZHEN Yu-guo2,3, ZHAO Wei2,3, ZHAO Xiao-li2, WANG Tao2,3, QIN Gui-xin3*
(1.College of Life Science, Jilin Agricultural University, Jilin Changchun 130118, China;2. Technology Center of Changchun Borui Feed Co. LD, Jilin Changchun, 130114, China;3. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Jilin Changchun 130118, China)

This study was conducted to investigate the effect of different fermentation time of Yeast (Saccharomyces cerevisiae) Culture on the intestinal microbiota. One-day-old AA 336 broilers with the comparable relative quality were randomly assigned to 7 groups with 6 replicates of 8 broilers each. The broilers in the control treatment A were only fed a basal diet ,and treatment B, C, D , E, F were yeast culture groups, supplemented with fermentation time at 12 h, 24 h, 36 h, 48 h and 60 h of yeast culture,and treatment G was Diamond V XP , respectively. The experiment was based on 42 d to 7 d preliminary trial period. After 42 d. Cecum contents were collected and the intestinal microbiota was detected by Miseq high-throughput sequencing technology. The results showed as follow: Compared with the control group, at 7～42 d, averaged daily gain (ADG)in C and D group were signi fi cantly higher (P<0.05), and that two groups of feed to gain ratio(F/G)were signi fi cantly lower.D group had the highest intestinal microbiota diversity while C group, exhibited the lowest species diversity. In the phylum level, Firmicutes was the most abundant bacterial in 7 groups, while the proportion of Verrucomicrobia was higher in C group was against the other group. In the genus level,Bacteroides, Faecalibacterium, lactobacillus, Blautiawere the more abundant bacterial in 7 groups. In conclusion, different time of fermentation of yeast culture has a signi fi cant effect on intestinal fl ora,and thus we can control composition metabolites of yeast culture by adjusting the fermentation time, in turn, adjusting the structure of intestinal fl ora, affect the production performance of animal.

Yeast culture(YC); Intestinal microbiota; High-throughput sequencing technology

S831.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-12-067

2017-10-27；

2017-11-06

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目（2015181））

孙吉吉（1986-），女，吉林长春人，博士研究生，讲师，主要从事动物营养与代谢调控研究，E-mail：sunzhe198615@163.com

*通讯作者：秦贵信，教授，博士生导师，E-mail：qgx@jlau.edu.cn