国内荷斯坦种公牛HH4遗传缺陷基因筛查

劳兰兰 ，吕小青 ，刘 林 ，肖 炜 ，张 毅 *

（1.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；2.北京奶牛中心，北京 100192；3.北京市畜牧总站，北京 1001070）

国内荷斯坦种公牛HH4遗传缺陷基因筛查

劳兰兰1，吕小青2，刘 林2，肖 炜3，张 毅1*

（1.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；2.北京奶牛中心，北京 100192；3.北京市畜牧总站，北京 1001070）

HH4是新近在荷斯坦牛中发现的一种遗传缺陷，其分子机理为牛1号染色体上的GART基因编码区内的1个A/C错义突变。该遗传缺陷呈隐性遗传、突变等位基因纯合时，导致胚胎早期死亡。本研究针对HH4建立了基于PCR-RFLP技术的分子检测方法。结果表明：通过对466头国内荷斯坦种公牛进行基因筛查，发现6头携带者，均可以追溯到共同的祖先公牛Besne Buck。建议我国今后进口荷斯坦种牛时，对个体进行系谱分析和遗传缺陷基因分子检测，避免引入有害基因；同时，对国内现有荷斯坦公牛群体进行HH4筛查，明确标注每头公牛的携带状态，以便在生产实践中合理选种选配。

荷斯坦牛；遗传缺陷；HH4；PCR-RFLP

近几十年来，由于对产奶性能的高强度选育，荷斯坦牛群体的近交程度不断增加。根据美国奶牛育种委员会（CDCB）统计数据，2000年出生的美国荷斯坦母牛平均近交系数为4.55%，2015年为6.58%，以每年约0.13%的速率不断递增（https://www.uscdcb.com/eval/summary/inbrd.cfm）。近交的不断积累也增加了群体内遗传缺陷基因快速扩散的风险。

最近几年，随着基因组数据在奶牛育种中的广泛应用，多种新的奶牛遗传缺陷基因被发现[1-5]。继Van Raden等[1]首先在荷斯坦牛中发现了3种致死的隐性遗传缺陷单倍型（HH1、HH2和HH3）后，法国科学家Fritz等[2]又发现一种新的隐性致死遗传缺陷单倍型，纯合时导致胚胎早期死亡，母牛流产，即HH4。对法国荷斯坦牛群繁殖纪录的统计分析表明，HH4携带者种公牛的女儿如果再与携带者公牛交配，青年母牛妊娠率降低5.80%，经产母牛妊娠率降低1.74%[2]。通过对25头荷斯坦牛进行全基因组测序，明确了HH4遗传缺陷单倍型的致病机理是牛1号染色体的GART（Glycinamide Ribonucleotide Transformylase）基因编码区内发生A/C突变，导致编码的氨基酸从天冬酰胺突变为苏氨酸。GART基因编码甘氨酰胺核苷酸转甲酰基转移酶，在嘌呤的生物合成中起关键作用，发生突变后GART功能丧失，阻碍嘌呤合成，最终导致胚胎在妊娠早期死亡[2]。

本研究旨在建立准确、简便的HH4遗传缺陷分子检测方法，同时筛查国内荷斯坦公牛HH4携带者。

1 材料与方法

1.1 样品 采集466头中国荷斯坦种公牛冻精样品，采用高盐法从牛冻精中提取基因组DNA[6]。

1.2 PCR-RFLP检测方法的建立

1.2.1 PCR引物设计 通过Ensembl数据库（http://asia.ensembl.org/index.html），查找GART基因的部分序列（BTA1: 1277027-1277427，UMD 3.1），以该序列为模板进行PCR引物设计及酶切位点分析。利用在线酶切位点分析工具NEBcutter（http://tools.neb.com/NEBcutter2/），查找能够识别突变位点的限制性内切酶，发现MseI特异性识别AATT序列，可以切开野生型等位基因，而不能切开突变型基因。利用Primer3.0软件设计引物（表1），野生型扩增片段有3个MseI酶切位点，将276 bp的片段切为4个片段（154、59、58、5 bp）；突变型由于A>C突变，导致1个酶切位点消失，从而只产生3个片段（154、117、5 bp）。因此通过观察酶切产物是否存在117 bp条带，即可筛查隐性有害基因的携带者。

1.2.2 PCR扩增 PCR反应体系总体积25 μL：基因组DNA模板50～100 ng，上、下游引物各10 pmol，Taq酶0.75 U，10×Buffer 2.5 μL，dNTP混合物（各2.5 mmol/L）2 μL。

PCR反应条件：94℃预变性5 min；然后35个循环，94℃变性30 s，60℃复性 30 s，72℃延伸30 s；最后72℃延伸7 min。

1.2.3 PCR产物的凝胶电泳检测 制作浓度为2%的琼脂糖凝胶，取每个样品的PCR产物3 μL点样，在TAE缓冲液中120V电压下电泳20 min。在凝胶成像系统中观察电泳结果，为单一的276 bp条带。

1.2.4 限制性酶切 PCR产物直接进行酶切，酶切反应总体积20 μL ：PCR产物10 μL，MseI内切酶10 U，10×Buffer 2 μL，ddH2O 7 μL。在水浴锅中37℃消化2 h。

1.2.5 酶切产物的凝胶电泳检测 制作浓度为4%的琼脂糖凝胶，取每个样品的酶切产物4 μL点样，在TAE缓冲液中110V电压下电泳25 min。

2 结 果

本研究设计的引物PCR扩增条带单一且清晰，扩增片段大小为276 bp，与目的片段大小一致。酶切反应后根据电泳条带模式，准确区分GART基因致死突变的基因型，从而确定遗传缺陷基因的携带者（图1）。其中，野生型酶切产物具有2个条带，分别为154 bp和59 bp（58 bp），而5 bp条带无法观察到；携带者酶切产物除了上述2条带外，还有1个117 bp的条带。

通过对466头荷斯坦种公牛进行分子检测，共发现6头携带者。对PCR产物进行测序，结果如图2所示，携带者个体在基因组物理位置BTA1：1277227（UMD3.1）存在AC套峰，为杂合子；其他个体该位置均为A，为野生型。PCR产物测序结果进一步验证了本研究建立的PCR-RFLP检测方法的准确性。

图1 GART基因隐性有害突变位点的PCR-RFLP检测结果

表1 引物序列信息

图2 牛GART基因隐性有害突变携带者部分PCR产物测序结果

利用中国奶牛数据中心（http://www.holstein.org.cn/）以及加拿大奶牛网（https://www.cdn.ca/）的系谱数据，对本研究所筛查到的6头携带者进行系谱追溯，结果发现它们都可以追溯到法国公牛Jocko Besn及其父亲Besne Buck（图3）。

图3 HH4遗传缺陷基因携带者公牛系谱追溯

3 讨 论

HH4是Frizt等[2]发现的一种荷斯坦牛隐性致死单倍型，该遗传缺陷可以追溯的最早祖先为法国公牛Besne Buck（法国注册号为4486041658），出生于1986年。这是一个著名的公牛家系，在加拿大CDN奶牛数据库中（https://www.cdn.ca/），Buck本身有259个女儿和118个儿子；其中儿子Jocko Besn（法国注册号为5694028588），出生于1994年，也是1头著名公牛，它的儿子被广泛应用[7]。HH4在法国荷斯坦牛中的频率为3.6%[2]，但在美国牛群频率只有0.37%[8]。说明该突变可能主要存在于欧洲荷斯坦牛群中。本研究在我国466头荷斯坦种公牛中筛查到HH4携带者公牛6头，提示该缺陷基因在中国荷斯坦牛中的频率较低，这可能是由于我国近年来主要从北美及澳大利亚引进种公牛，而从欧洲引入的公牛较少。

本研究对6头HH4携带者系谱分析发现，其中4头父亲为德国公牛，2头父亲为加拿大公牛，它们都可以追溯到共同祖先Besne Buck和Jocko Besn，由此推断中国荷斯坦牛群体中的HH4是在荷斯坦牛的进口过程中带入的。为了降低HH4遗传缺陷对中国荷斯坦牛群体的危害，应积极采取相应的措施。建议今后进口荷斯坦种牛时，应进行详细的系谱分析，检测个体的HH4携带情况，避免引入遗传缺陷基因；其次，对国内现有的荷斯坦公牛群体，应进行HH4分子检测，明确标注每头公牛的携带状态，以便在生产实践中合理选配[9]，避免杂合子交配造成的经济损失。

本研究建立的PCR-RFLP检测方法，操作简单方便，在普通的分子实验室就能完成，且成本较低，可以用于国内荷斯坦牛HH4遗传缺陷的常规分子检测。

[1]VanRaden P M, Olson K M, Null D J,et al. Harmful recessive effects on fertility detected by absence of homozygous haplotypes[J]. J Dairy Sci, 2011, 94(12):6153-6161.

[2] Fritz S, Capitan A, Djari A,et al. Detection of haplotypes associated with prenatal death in dairy cattle and identification of deleterious mutations inGART, SHBGandSLC37A2[J]. PLoS One, 2013, 8(6): e65550.

[3]Daetwyler H D, Capitan A, Pausch H,et al. Whole-genome sequencing of 234 bulls facilitates mapping of monogenic and complex traits in cattle[J]. Nat Genet, 2014, 46(8):858-865.

[4]Adams H A, Sonstegard T S, VanRaden P M,et al.Identification of a nonsense mutation inAPAF1that is likely causal for a decrease in reproductive efficiency in Holstein dairy cattle[J]. J Dairy Sci, 2016, 99(8): 6693-6701.

[5]Schütz E, Wehrhahn C, Wanjek M,et al. The Holstein Friesian Lethal Haplotype 5 (HH5) results from a complete deletion ofTBF1Mand cholesterol deficiency (CDH)from an ERV-(LTR) insertion into the coding region ofAPOB[J]. PLoS One, 2016, 11(4): e0154602.

[6] 范学华, 张毅, 公维嘉, 等. 我国荷斯坦种公牛 CVM 遗传缺陷基因的分子检测[J]. 中国畜牧杂志, 2010, 46 (19):14-18.

[7] Segelke D, Täubert H, Reinhardt F,et al. Considering genetic characteristics in German Holstein breeding programs[J]. J Dairy Sci, 2016, 99(1): 458-467.

[8]Cole J B, Null D J, VanRaden P M. Phenotypic and genetic effects of recessive haplotypes on yield, longevity, and fertility[J]. J Dairy Sci, 2016, 99(9): 7274-7288.

[9] Cole J B. A simple strategy for managing many recessive disorders in a dairy cattle breeding program[J]. Genet Select Evol, 2015, 47: 94.

Carrier Screening for Genetic Defect HH4 in Chinese Holstein Bulls

LAO Lan-lan1, LV Xiao-qing2, LIU Lin2, XIAO Wei3, ZHANG Yi1*
(1.College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China;2.Beijing Dairy Cattle Center, Beijing 100192, China;
3
. Beijing General Station of Animal Husbandry, Beijing 100012, China)

HH4 is an autosomal recessively inherited disorder recently identi fi ed in Holstein cattle. The molecular mechanism of HH4 has been identi fi ed as a A/C missense mutation inGARTgene on chromosome 1(BTA1), which leads to loss of gene function. The embryo with homozygous defective alleles will die during early pregnancy. In the current study, a polymerase chain reaction–restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method was established to detect carriers of HH4 in 466 Chinese Holstein bulls. As a result, six carrier were identi fi ed, indicating a low frequency of HH4 carriers in Chinese Holstein population. In order to reduce economic loss caused by HH4, pedigree analysis and molecular assay should be performed before the genetic materials of Holstein cattle are introduced into China. Meanwhile, all active Chinese Holstein bulls should be routinely screened for HH4 and labeled in the pedigree, which allows a more effective mating program.

Holstein; Genetic defect; HH4; PCR-RFLP

S823.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-12-033

2017-05-30；

2017-07-13

国家科技支撑计划项目（2011BAD28B02）；北京市奶牛产业创新团队项目（BAIC06-2017）；现代农业（奶牛）产业技术体系建设专项资金（CARS-37）

劳兰兰（1991-），女，山东滨州人，硕士研究生，E-mail：laolanlan1991@163.com；并列第一作者，吕小青（1981-），女，山西人，博士研究生，E-mail：13810787287@139.com

*通讯作者：张毅（1979-），副教授，E-mail：yizhang@cau.edu.cn