Ghrelin及其相关基因 mRNA在海兰褐蛋鸡不同产蛋阶段的表达变化

胡善明，李家俊，孙 浩，赵 莹，马金友，张艳红，余 燕

（河南科技学院动物科技学院，河南新乡453003）

Ghrelin及其相关基因 mRNA在海兰褐蛋鸡不同产蛋阶段的表达变化

胡善明，李家俊，孙 浩，赵 莹，马金友，张艳红，余 燕*

（河南科技学院动物科技学院，河南新乡453003）

本文旨在探讨海兰褐蛋鸡Ghrelin、Ghrelin受体（GHSR）和Ghrelin酰基转移酶（GOAT）在产蛋周期不同阶段的表达变化规律，为通过诱导Ghrelin表达促进蛋鸡卵泡生长发育以提高产蛋率及延长产蛋周期提供理论依据。应用ELISA检测蛋鸡产蛋周期血浆和卵巢Ghrelin含量，实时定量PCR检测腺胃与卵巢Ghrelin、GHSR和GOAT表达变化。结果表明：不同产蛋阶段外周血Ghrelin的含量和腺胃中Ghrelin、GHSR和GOATmRNA的表达变化不明显；产蛋高峰期卵巢中GhrelinmRNA表达水平比产蛋前期升高98.2%（P<0.05），而产蛋后期Ghrelin表达水平比产蛋高峰期有所下降（P>0.05）；GHSR和GOAT的表达模式和Ghrelin基本一致，均表现为产蛋高峰期表达量最高，产蛋后期略有下降，产蛋高峰期GHSR和GOATmRNA表达水平显著高于产蛋前期和产蛋后期（P<0.05），但产蛋前期和后期差异不显著（P>0.05）。推测海兰褐蛋鸡卵巢中Ghrelin、GHSR和GOAT的转录表达水平与产蛋周期具有一定的相关性。

Ghrelin；Ghrelin受体；Ghrelin酰基转移酶；产蛋周期；海兰褐蛋鸡

Ghrelin是具有多种生物学功能的多肽，它与生长激素促分泌素的受体（GHSR）结合，在生长激素分泌、生殖、摄食、能量代谢等方面起作用[1]，Ghrelin酰基转移酶（GOAT）可调节Ghrelin在血液中的水平[2-3]。哺乳动物的研究发现，Ghrelin及其受体GHS-R1a能够在卵巢的不同细胞上表达，表明Ghrelin对卵巢生理具有直接的调控作用[4-5]。

鸡Ghrelin是具有26个氨基酸残基的多肽，主要由鸡腺胃分泌，但在鸡卵巢组织中也有表达，且通过与GHS-R1a结合参与鸡卵巢组织中一些重要功能的调节，培养的卵巢粒细胞添加Ghrelin的量可以降低凋亡相关蛋白如CASPASE-3和BCL-2的含量，提高增殖细胞核抗原、细胞周期蛋白B1和p53蛋白在卵巢滤泡细胞的表达，促进孕酮、雌二醇和精氨酸催产加压素释放[6]。Ghrelin还能够促进鸡等级前卵泡颗粒细胞的增殖，协同卵泡刺激素（FSH）调节卵泡的发育[7]，通过卵巢滤泡的粒细胞影响卵巢激素的分泌[8]。由此可见，Ghrelin对鸡卵泡发育也具有一定的调节功能，然而蛋鸡产蛋不同阶段Ghrelin的表达水平尚未见直接报道。本实验运用实时定量PCR（Quantitative Real Time PCR，qRTPCR）和ELISA方法对Ghrelin、GHSR和GOATmRNA在鸡卵巢和腺胃的表达水平及血浆和卵巢中Ghrelin的含量变化进行检测和分析，以探讨其表达水平与海兰褐蛋鸡产蛋各时期的对应关系，为通过诱导Ghrelin表达提高产蛋率及延长产蛋高峰期提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及样品采集 从河南省新乡市某鸡场选取产蛋前期、产蛋高峰期和产蛋后期的海兰褐母鸡各3批，每批12只，各时期每批随机选取3只鸡，肝素与血液比例1:10，心脏采血4 mL，低温4℃5 000 r/min 离心5 min，收集血浆待测。然后按100 mg/100 g 体重乌拉坦麻醉，颈动脉放血处死，解剖分别取其部分腺胃和卵巢组织，预冷的PBS冲洗后放入液氮冷冻，放置于超低温冰箱内保存，用于后续的ELISA分子生物学实验，取材后的母鸡投入实训中心化粪池。

1.2 总RNA提取和cDNA合成 总RNA提取：将收集的各时期卵巢和腺胃，同一时期的3只鸡组织样品为一组，置于液氮中研磨，称取少于0.1 g研磨样品加入TRIzol（15596018，Invitrogen）1 mL裂解细胞，将RNA释放到溶液中，加入氯仿室温放置15 min，12 000 ×g 4℃离心后吸取上层水相到一新管并加入异丙醇沉淀RNA 8 min，12 000 ×g 4℃离心后弃上清，75%乙醇（DEPC水配）洗沉淀2次，室温干燥5 min，加入Rnase free water 充分溶解沉淀，检测RNA浓度和OD值（A260/A280），分装放置于超低温冰箱内保存备用。

cDNA合成：取1 μg总RNA，根据PrimeScriptTM反转录试剂盒（RR047A，TaKaRa）说明配制10 μL反应体系去除总RNA中的基因组DNA，反应在PCR仪上进行，条件： 42℃ 2 min，4℃保持；反应完毕后进行反转录反应，总体系20 μL，前述反应液10 μL，加入配制的反转录混合液10 μL，混匀后立即放入PCR仪进行反应，条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保持，反应完毕后-20℃保存备用。

1.3 ELISA实验

1.3.1 组织匀浆 将产蛋前期、产蛋高峰期和产蛋后期的鸡卵巢按1:1比例加入遇冷的PBS冰上匀浆，5 000 ×g 离心 10 min，取上清备用。

1.3.2 ELISA检测 按下述步骤采用ELISA法检测血浆和卵巢中Ghrelin含量：①取出试剂盒（Chicken Ghrelin ELISA Kit， CSB-E14230C，CUSABIO），于室温（20～25℃）放置15～30 min复温，实验过程在室温（20～25℃）下进行；②每孔加入100 μL顺序标记的标准品溶液；③实验孔中加入100 μL待测血浆或卵巢匀浆上清，对照孔加入100 μL灭菌双蒸水；④每孔加入50 μL酶标液；⑤将酶标板密封后，37℃反应1 h；⑥磷酸缓冲液（PBS，pH=7.32）洗涤酶标板3次后彻底拍干；⑦分别加A、B液显色剂各50 μL，避光反应15 min；⑧加入50 μL终止液停止反应；⑨30 min内在酶标仪上读取各孔的OD值，计算Ghrelin含量。

1.4 qTR-PCR 为了研究海兰褐蛋鸡产蛋周期不同阶段基因变化情况，qTR-PCR方法被用来检测腺胃和卵巢GHRELIN、GHSR和GOAT基因的转录表达变化，引物和实验程序参照文献[9]。GHSR的引物根据GenBank的序列（序列号：NM_204394）设计，F：TCTTTTTCCTGCCCGTATTCTGC，R：AGTCTGCTTGTTGTTCTTGTCCCTG。

1.5 统计分析 Excel录入数据，用平均值±标准差表示，采用单因子方差分析，数据应用SAS软件（Version 8.01，SAS Institute）进行多重比较，P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 海兰褐蛋鸡产蛋周期各阶段血浆和卵巢中Ghrelin含量变化 如表1所示，产蛋前期、产蛋高峰期和产蛋后期血浆中Ghrelin的含量分别是149.26、153.57、173.90 pg/mL（P>0.05）， 而 卵巢中没有检测到Ghrelin。

2.2 海兰褐蛋鸡产蛋周期各阶段腺胃中Ghrelin、GHSR和GOATmRNA的转录表达变化 由表2可见，腺胃中Ghrelin、GHSRmRNA的表达水平在产蛋前期、产蛋高峰和产蛋后期均没有明显变化（P>0.05），产蛋高峰期腺胃Ghrelin的转录表达水平比产蛋前期略有升高（P>0.05）。腺胃中GOAT的表达模式与Ghrelin和GHSR基本一致，表现为随产蛋时间的增加而升高（P>0.05）。

表1 海兰褐蛋鸡产蛋各阶段血浆Ghrelin含量变化 pg/mL

2.3 海兰褐蛋鸡产蛋周期各阶段卵巢中Ghrelin、GHSR和GOATmRNA的转录表达变化 如表2所示，产蛋高峰期卵巢内GhrelinmRNA的表达水平最高，为产蛋前期的1.98倍（P<0.05），产蛋后期GhrelinmRNA的表达水平较产蛋高峰期有所下降，比产蛋前期升高（P>0.05）。卵巢中GHSR和GOATmRNA的表达水平在产蛋高峰期最高，产蛋后期出现下降，且产蛋高峰期卵巢内GHSR和GOATmRNA表达水平显著高于产蛋前期和产蛋后期（P<0.05），但产蛋前期和产蛋后期差异不显著（P<0.05）。

表2 海兰褐蛋鸡产蛋各阶段腺胃和卵巢中Ghrelin、GHSR和GOAT mRNA的表达丰度

3 讨 论

本研究发现，海兰褐蛋鸡产蛋周期不同阶段血浆中Ghrelin含量变化无明显差异，各阶段腺胃中Ghrelin、GHSR和GOAT基因的转录表达也无显著差异，而卵巢Ghrelin、GHSR和GOAT基因在产蛋周期的高峰期表达水平最高，与产蛋前期和产蛋后期有显著差异（除Ghrelin在产蛋后期变化不明显），表明产蛋周期各阶段卵巢Ghrelin、GHSR和GOATmRNA的转录表达模式与外周血和腺胃不一致。这与哺乳动物中的研究较为相似，即大鼠发情周期血清中的Ghrelin水平波动较小[4]，而GhrelinmRNA在卵巢黄体期表达最高，在动情前期表达最低[10]。杜晨光等[11]研究发现，绵羊卵巢中的GhrelinmRNA在成熟卵泡中的表达水平显著高于未成熟卵泡，且在发育阶段中呈现一定变化规律，人、大鼠、猪和绵羊等均发现随着黄体形成到成熟过程中，黄体Ghrelin表达逐渐升高，在退化期表达较低[12]。以上研究表明，哺乳动物卵巢Ghrelin对黄体的形成和卵泡的发育均有促进作用。本研究结果与哺乳动物卵巢Ghrelin的表达变化类似，即海兰褐蛋鸡在产蛋高峰期时，产蛋量最高，此时卵巢活动应最旺盛，卵巢Ghrelin的表达水平也最高，说明GhrelinmRNA的表达水平随着卵巢机能的增强而升高、随着卵巢机能的衰退而下降。在外周器官中，Ghrelin具有广泛的生物功能，从胃肠的分泌和运动到细胞的增殖调控，但在较小范围内，Ghrelin也能调控生长激素、黄体生成素（LH）、FSH、催乳激素、促肾上腺皮质激素和抗利尿激素等的分泌[6]，Ghrelin通过GHSR起作用[13]，推测下丘脑除调控外周血和腺胃Ghrelin外，可能通过调节卵巢Ghrelin来影响LH和FSH等生殖激素，以自分泌或旁分泌的方式调节卵巢的活动。Kaiya等[14]研究发现，鸡小脑和下丘脑中有GhrelinmRNA的表达，Ghrelin的免疫阳性细胞在禽类的大脑和小脑中有分布，也推测了Ghrelin可能以自分泌或旁分泌的方式调节中枢神经系统。Caminos等[4]在小鼠卵巢发现Ghrelin有自分泌或旁分泌的作用。

禽类产蛋周期各阶段卵巢中多数生殖激素的表达水平有明显的变化。研究发现，禽类产蛋周期的产蛋高峰期卵巢中FSH和雌激素的表达水平最高，显著高于产蛋前期和产蛋后期[15]，与本研究结果一致。慈光新等[7]研究发现，Ghrelin可促进鸡等级前卵泡颗粒细胞的增殖，协同FSH调节卵泡的发育，这也进一步说明卵巢Ghrelin可受到其他激素影响，并可与其他性腺激素起到协同作用。

Sirotkin等[6]研究表明，Ghrelin和GHS-R1amRNAs在鸡卵巢的表达直接影响鸡卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡，可能是卵巢分泌活动的调节因子，调节卵巢功能，如增殖、凋亡和激素分泌等。本研究结果也表明，Ghrelin、GHSR和GOATmRNA的表达水平在产蛋高峰期明显增加，推测卵巢Ghrelin可能协同其他激素对蛋鸡产蛋高峰期开始时间或蛋鸡产蛋高峰期持续时间起到调控作用，这对探索蛋鸡生产等方面的研究有一定的指导作用。

此外，本实验未检测到卵巢中Ghrelin的存在，推测卵巢自身分泌的Ghrelin量较低，用现有的ELISA试剂盒（检测范围：25 ～ 400 pg/mL）未能检出。Ghrelin是一种肽激素，微量的蛋白表达变化可能会对蛋鸡的产蛋情况带来意想不到的效果，因而出现产蛋周期的不同阶段产蛋量的变化。

4 结 论

本实验结果表明，卵巢中Ghrelin、GHSR和GOAT基因的表达与产蛋周期的不同阶段具有一定的相关性，推测Ghrelin及其相关基因在卵巢中的表达可能调节产蛋量和产蛋时间，这对研究养禽业提前蛋鸡产蛋高峰期时间和延长蛋鸡产蛋高峰期有很大的帮助。

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Expression Changes of Ghrelin and Ghrelin-Related Genes during Different Laying Stages of Hyline Brown Hens

HU Shan-ming, LI Jia-jun, SUN Hao, ZHAO Ying, MA Jin-you, ZHANG Yan-hong, YU Yan*
(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Institute of Science and Technology, Henan Xinxiang 453003, China)

In this study, Ghrelin content in plasma and ovarian, the expression level ofGhrelin,GHSR(growth hormone secretagogue receptor) andGOAT(ghrelin O-acyltransferase) mRNAs in ovarian and proventriculus of Hy-Line Brown chickens were detected using ELISA and qRT-PCR assays to explore the change regularity of chickenGhrelin,GHSRandGOATduring pre laying period, laying peak and late laying period. We hoped it would provide the theory basis for inducing the expression ofGhrelinto promote the growth and development of follicle and laying rate, and prolong the laying cycle. The results demonstrated that there were no obvious changes in plasma Ghrelin and the expression levels ofGhrelin,GHSRandGOATmRNA in proventriculus in the different laying period. In ovarian, however, the expression ofGhrelinmRNA in Laying peak period increased by 98.2% than that of pre-laying period (P<0.05), while the expression ofGhrelinmRNA in late laying period decline by 25% than that of laying peak, but there was no signi fi cant difference between them (P>0.05). The pattern ofGHSRandGOATmRNA expression in ovarian was the similar asGhrelinmRNA, which was higher expression levels in laying peak than pre-laying period and late laying period (P<0.05), but there was no signi fi cant difference between Pre laying period and late laying period (P>0.05). These results suggested that the expression levels ofGhrelin,GHSRandGOATmRNA in Hy-Line Brown chickens ovarian were related with its laying period.

Ghrelin;GHSR;GOAT; Laying period; HyLine brown layers

S831.1

A

10.19556/j.0258-7033.2017-12-022

2017-07-10；

2017-10-12

河南省高校科技创新团队项目（18IRTSTHN019）；河南省科技攻关项目（162102110038）；新乡市科技攻关项目（CXGG16026）

胡善明（1996-），男，河南光山人，本科生，E-mail：605526327@qq.com

*通讯作者：余燕（1972-），主要从事发育与繁殖生理研究，E-mail:yymtt03@163.com