高压氧治疗对大鼠创伤性脑损伤后Nogo—A及NgR表达的影响

涂杳然+牛凡+洪德全+胡勇

[摘要]目的 探讨高压氧治疗对大鼠创伤性脑损伤后Nogo-A及NgR表达的影响。方法 选取SPF级SD大鼠100只，利用Feeney自由落体撞击法制成急性中度创伤性脑损伤模型，将模型随机分为治疗组（n=20）和损伤组（n=80）。损伤组不做特殊处理、治疗组建模成功后进行高压氧治疗。观察两组大鼠创伤后第1、3、5、7、10天时间段内大鼠脑内Nogo-A及NgR的表达差异。结果 治疗组、损伤组大鼠均在创伤后第3天的Nogo-A及NgR表达最高，治疗组大鼠的Nogo-A及NgR的表达在创伤后第1、3、5、7、10天的Nogo-A及NgR表达均低于损伤组，差异均有统计学意义（P<0.01）。结论 高压氧治疗对下调Nogo-A及NgR表达是促进中枢神经再生的机制之一。

[关键词]高压氧治疗；创伤性脑损伤；Nogo-A及NgR表达；大鼠

[中图分类号] R749.16 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）11（c）-0007-03

Influence of hyperbaric oxygen therapy on the expression of Nogo-A and NgR after traumatic brain injury in rats

TU Yao-ran NIU Fan HONG De-quan HU Yong

Trauma Center，Third Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330008，China

[Abstract]Objective To investigate the influence of hyperbaric oxygen therapy on the expression of Nogo-A and NgR after traumatic brain injury in rats.Methods One hundred SD rats （SPF grade） were selected and established as acute moderate traumatic brain injury models using Feeney′s method.The models were randomly divided into treatment group （n=20） and injury group （n=80）.In the injury group，no special treatment was applied，while in the treatment group，hyperbaric oxygen was adopted after successful modeling.The differences in the expression of Nogo-A and NgR in rats 1，3，5，7 and 10 days after the trauma of rats in two groups were observed.Results The expression of Nogo-A and NgR were highest in the third day after trauma in both the treatment and injury groups.The Nogo-A and NgR expression in the treatment group were all lower than those in the injury group 1，3，5，7 and 10 days after the trauma，and the differences were statistically significant （P<0.01）.Conclusion Down-regulation of Nogo-A and NgR expression by hyperbaric oxygen is one of the mechanisms of promoting central nerve regeneration.

[Key words]Hyperbaric oxygen therapy；Traumatic brain injury；Nogo-A and NgR expression；Rats

中樞神经系统内神经轴突生长抑制因子-A（neurite outgrowth inhibitor-A，Nogo-A）与其受体（nogo receptor，NgR）结合后可抑制轴突生长，主要通过激活细胞内炎症信号核转录因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）通路引或改变胞内钙离子浓度实现[1]。研究发现，运用高压氧治疗创伤性脑损伤（TBI），可对神经系统功能有不同程度的改善，但其机制并不明确[2]。因此本研究考察高压氧治疗对大鼠中度创伤性脑损伤后不同时间段脑内Nogo-A和NgR受体表达的影响，探讨高压氧治疗对大鼠创伤性脑损伤后神经功能的影响及创伤时间与Nogo-A、NgR表达的相关性，现报道如下。

1材料

1.1实验动物

SPF级SD大鼠100只，体重（250±30）g，20～25℃室温下培养，标准饲养、自由进食、进水，自然光照。

1.2试剂

sABC试剂盒，DAB显色试剂盒，兔抗Nogo-A IgG，兔抗NgR，以上试剂均由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.3仪器

大型高压氧舱，由解放军九四医院提供；动物饲养设备，手术器械，麻醉药品，荧光显微镜，免疫荧光分析仪，Feeney撞击装置，组织切片机等仪器均由南昌市第一医院中心实验室及病理科提供。endprint

1.4方法

1.4.1脑损伤大鼠模型的制备 将损伤组、治疗组的大鼠制成急性中度创伤性脑损伤模型，用10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠；麻醉满意后将大鼠固定于操作台上，剪掉頭顶毛发，用7%酒精消毒皮肤，沿矢状缝切开2 cm切口，剥离皮下组织及颅骨骨膜，用电钻在硬膜外、冠状缝后1.5 mm，矢状缝右侧2.5 mm处开一个直径5 mm骨窗，去除骨残片，生理盐水冲洗。采用自由落体致伤撞击装置，根据Feeney法，将撞击杆头端至于骨窗内，保持撞击杆与地面垂直，于30 cm高度处将20 g撞击锤释放，冲击撞杆，撞击鼠脑。撞击完成后迅速抬起撞击杆。若发生出血，用棉球轻按至止血。清理术野，间断缝合切口。先将大鼠转移至保暖垫上，待出现身体活动后，再移回鼠笼。将模型随机分为治疗组（n=20）和损伤组（n=80），损伤组又随机分为创伤后第1天（n=16）、第3天（n=16）、第5天（n=16）、第7天（n=16）和第10天（n=16）5个小组。

1.4.2高压氧治疗 建模成功后，将治疗组大鼠放入高压氧治疗箱的高压氧舱行高压氧治疗。

1.4.3免疫组织化学检测 ①脑组织切片制作：用10%水合氯醛将大鼠过量麻醉，确定大鼠无痛觉反应后，用室温生理盐水和4℃的4%多聚甲醛行心脏灌流。灌流完成后打开颅腔取下大脑，运用锋利薄刀片切取大小约为1 mm的脑组织，切片时注意切勿挤压与用力。将所取脑组织浸入3%戊二醛溶液中进行固定。固定后用磷酸盐缓慢冲洗3次，每次10 min，缓慢冲洗后运用四氧化锇进行再次固定2 h，然后再次运用磷酸盐缓慢冲洗3次，每次10 min；后脱水，在丙酮与包埋剂1：1的条件下进行浸透，然后进行包埋聚合，运用硝酸铅与醋酸铀染色，染色后裱于胶质包被的载玻片上，烘干后于常温阴暗干燥处保存备用。②免疫组化测定大鼠创伤灶边缘Nogo-A及NgR蛋白：取所制脑组织切片，运用二甲苯、乙醇脱蜡，在3%双氧水中孵育15 min，蒸馏水冲洗3 min；PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤3次，每次3 min。在高压热下进行抗原修复；修复后再次PBS洗涤3次。配置并滴加一抗40～50 μl置入37℃烤箱内孵育1 h，然后室温下放置30 min并PBS洗涤3次。滴加二抗，同样于37℃烤箱内孵育1 h，再次PBS洗涤3次。BAB显色，自来水洗涤，脱水、封片。在普通显微镜下观察结果，利用荧光显微镜成像摄片，用Image J软件将结果量化。

1.5统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组大鼠创伤灶边缘不同时间段Nogo-A表达的比较

在创伤后第3天，两组大鼠脑内Nogo-A表达最高，治疗组大鼠的Nogo-A表达在创伤后第1、3、5、7、10天均明显低于损伤组，差异有统计学意义（P<0.01）（表1）。

2.2两组大鼠创伤灶边缘不同时间段NgR表达的比较

创伤后第3天，两组大鼠脑内NgR表达最高，治疗组大鼠在创伤后第1、3、5、7、10天的脑内NgR表达均明显低于损伤组，差异有统计学意义（P<0.01）（表2）。

3讨论

Nogo-A蛋白是存在于髓鞘中的一种轴突再生抑制因子[3]。研究证明，Nogo蛋白的编码基因为nogo，属于网状蛋白质家族，主要分布于中枢神经系统少突胶质细胞内。Nogo-A由1个Nogo蛋白共有的188个氨基酸羧基末端以及2个跨膜结构域和一个巨大的氨基末端组成。Nogo-A具有2个抑制性功能结构域，一个是跨膜环状Nogo-66，位于细胞，另一个是较长的氨基端区（amino-Nogo），定位于胞质内[4-5]。

NgR是Nogo-A的特异性受体，广泛分布于中枢神经系统中，在灰质中含量最高[6-7]。NgR由1个肽信号、8个富含亮氨酸的重复序列、1个富含半胱氨酸的重复序列羧基端和1个糖基磷脂酰肌醇偶联跨膜区组成[8]。

多种造模研究发现，Nogo-A抗体或NgR拮抗剂后，可明显下调Nogo-A和NgR的表达，可促使中枢神经轴突再生，对神经功能恢复有重要意义[9-10]。研究表明，成年恒河猴单侧颈髓损伤后运用Nogo-A抗体可明显使其运动功能得到恢复。也有研究证明，Nogo-66拮抗剂可治疗大鼠脊髓损伤，促进大鼠中枢神经轴突生长，恢复大鼠功能。此外，还有相关实验证明，运用NgR疫苗法，使大鼠体内产生NgR抗体，可对受损的中枢神经其明显恢复作用[11-13]。大量实验表明，在创伤性脑损伤中，Nogo-A及NgR的异常表达贯穿整个过程[14]。

随着科技发展，高压氧疗法已被广泛运用与脑外伤治疗中，且受广大学者关注，因其疗效明确，目前已成为脑外伤后重要的辅助治疗手段[15]。本研究中，运用高压氧对脑损伤后大鼠进行治疗，明显降低了大鼠脑内Nogo-A及NgR的表达水平，从而减轻脑水肿，促进中枢神经细胞恢复。研究结果提示，两组大鼠在脑损伤后第3天的Nogo-A及NgR表达最高，而后逐渐降低，且治疗组所有时间段内Nogo-A及NgR的表达水平均低于损伤组，差异有统计学意义（P<0.01）。

综上所述，高压氧治疗下调Nogo-A及NgR的表达水平，是促进中枢神经系统再生的机制之一，因实验所选研究样本数量较少，研究结论仍需扩大样本数量进一步研究探讨。

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（收稿日期：2017-09-19 本文编辑：孟庆卿）endprint