雷公藤甲素诱导急性髓细胞白血病干细胞凋亡及其机制*

郑维威 吕长坤 张文静

·基础实验·

雷公藤甲素诱导急性髓细胞白血病干细胞凋亡及其机制*

郑维威 吕长坤 张文静

目的 探讨雷公藤甲素诱导急性髓细胞白血病干细胞凋亡的分子机制。方法 采用MTT法检测雷公藤甲素对KG-1细胞的增殖抑制作用，计算出IC50值，按照浓度梯度用雷公藤甲素处理KG-1细胞48 h，流式细胞仪检测细胞凋亡变化。Western blot法检测Bcl-2、β-catenin、p-AKT和AKT 等蛋白的变化。结果 雷公藤甲素对KG-1细胞的增殖抑制呈剂量依赖性，IC50值约为4 nmmol/L，其还可诱导KG-1细胞凋亡。雷公藤甲素能够下调Bcl-2、β-catenin，p-AKT等蛋白的表达水平。结论 雷公藤甲素诱导KG-1细胞的分子机制可能与Bcl-2、β-catenin、p-AKT的下调有关。

雷公藤甲素 髓细胞白血病干细胞 凋亡

急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一种造血干细胞的恶性克隆性疾病。目前研究表明AML干细胞是AML起源及难治复发的关键。AML干细胞具有自我更新能力以及无限再殖潜力，对化疗药物耐药[1]。因此。寻找针对AML干细胞的治疗药物是AML最根本的治疗策略。雷公藤甲素是从中草药雷公藤中提取出来的一种环氧二萜内酯成分，具有一定的抗肿瘤作用，近年来广受关注[2]。为探讨雷公藤甲素抗急性髓细胞白血病干细胞的分子机制，我们开展了相关实验研究，现将结果报告如下。

材料与方法

1 试剂及抗体 雷公藤甲素购自Sigma公司，RPMI 1640细胞培养基购于上海生工；胎牛血清购于Biological Industries；MTT 粉剂购于Sigma公司；一抗：β-catenin，p-AKT，AKT和Bcl-2购于CST；GAPDH购于康成生物；二抗：HRP偶联的抗兔、抗鼠购于康成生物；PVDF 膜购于上海生工；ECL购于PIERCE公司。AV/PI细胞凋亡试剂盒购于美国BD公司。FITC标记小鼠抗人CD34单克隆抗体、PE标记小鼠抗人CD38单克隆抗体购于BD美国公司，AnnexinV/FITC凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物有限公司，RIPA裂解液购于碧云天公司。

2 细胞培养及分选 将人AML细胞株KG-l细胞株（来自浙江大学肿瘤研究所）置于含10%胎牛血清的1640培养基中（含1%青-链霉素），置37℃、5% CO2饱和湿度培养箱，实验所用细胞均处于对数期。应用CD34-FITC、CD38-PE和Anti-FITC、PE分别标记KG-1，使用流式细胞仪分选出CD34+CD38-KG-1细胞。

3 MTT法检测雷公藤甲素对KG-1细胞的增殖抑制作用 将细胞悬液（5×104/ml）加入到96孔培养板中，每孔100 μl，培养4 h后，根据实验要求加入不同浓度的雷公藤甲素100 μl，另设空白孔，不加药对照，每组6个复孔。培养48 h后，每孔加入20 μl的5 mg/ml的MTT溶液，反应4 h，离心吸去培养基，每孔加200 μl DMSO摇匀后，用酶标仪（波长570 nm）测吸光度值（A）。利用公式测定抑制率（%）=（1–A实验组/A对照组）×100%，然后用Graphpad计算出IC50。

4 流式细胞仪检测雷公藤甲素诱导KG-1细胞凋亡比例 KG-1细胞（1×105/ml）按照0、2、4、8、16 nmol/L浓度，加入雷公藤甲素处理，48 h 后收集细胞，用冷的PBS洗2遍，取1×106个细胞加入1 ml结合缓冲液重悬，取100 μl加入Annexin V/FITC 5 μl和PI 5 μl，混匀室温避光孵育15 min，然后加入400 μl结合缓冲液，采用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。

5 Western blotting检测雷公藤甲素对KG-1细胞Bcl-2、β-catenin、p-AKT和AKT 等蛋白的影响

KG-1细胞（1×105/ml）按照0、2、4、8、16 nmol/L浓度，加入雷公藤甲素处理，48 h后收集细胞，蛋白裂解液冰上裂解20 min，4 ℃、12 000g离心10 min，提取上清总蛋白。取20 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜，用含5%奶粉的TBST室温1 h。一抗4 ℃过夜，二抗室温1 h，ECL显影，胶片曝光成像。

6 统计学处理 应用SPSS17.0软件，多个样本均数的比较采用方差分析，以均数±标准差表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 雷公藤甲素对KG-1细胞的增殖抑制作用 随着浓度的增高，抑制作用增强，提示雷公藤甲素对KG-1细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖关系。TPL对KG-1细胞的IC50值为4 nmol/L。见图1。

2 雷公藤甲素诱导KG-1细胞的凋亡 根据课题组前期研究[3]，分别用0、2、4、8、16 nmol/L的雷公藤甲素处理KG-1细胞48 h 后，细胞的凋亡比例分别为1.5%、12.5%、15.9%、24.0%和43.5%，随着药物浓度的上升而增加，呈剂量依赖性（图2），提示雷公藤甲素能够诱导KG-1细胞凋亡。

3 雷公藤甲素对KG-1细胞Bcl-2、β-catenin、p-AKT和AKT 等蛋白表达的影响 Western blotting检测结果显示，0、2、4、8、16 nmol/L雷公藤甲素处理KG-1细胞48 h后，随着药物浓度的增高，Bcl-2、β-catenin、p-AKT等蛋白的表达水平降低，提示雷公藤甲素能够下调Bcl-2、β-catenin、p-AKT等蛋白的表达（图3）。

图1 雷公藤甲素对KG-1细胞的增殖抑制作用

图2 雷公藤甲素可诱导KG-1细胞的凋亡

图3 雷公藤甲素对KG-1细胞Mcl-1,β-catenin，p-AKT和AKT 表达的影响

讨 论

目前的观点认为，AML干细胞在AML耐药中扮演着十分重要的角色，是AML治疗失败的根本原因，针对AML干细胞的靶点成为AML治疗的选择手段之一。AML干细胞很难通过化学治疗杀灭，其自我更新与复制将使AML的治疗更加困难，因此，临床上一直在寻找特异性杀伤AML干细胞的方法[4]。本实验所用的KG-1细胞来源于AML-M0男性患者，对常规AML化疗药物天然耐药。该细胞系高表达CD34、CD123，基本不表达CD38，经过流式细胞仪检测，其 CD34+CD38–比例高达95.3%。有研究表明，KG-1a细胞经过流式细胞仪分选，其 CD34+CD38–比例为98.15%，且82.4%的细胞位于G0/G1期[5]，这两种细胞均高度符合AML干细胞的免疫表型，故我们将该细胞系用于AML干细胞的功能及机制研究。

雷公藤甲素具有广谱、高效的抗肿瘤作用，对急性白血病、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌等都有较高活性[6]。研究表明，低浓度的TPL可以提高去甲氧柔红霉素（IDA）诱导白血病干细胞的凋亡比例，低TPL（IC20浓度：5 nm）显著增强了去甲氧柔红霉素杀伤LSC的效果。TPL联合IDA减少了LSC中HIF-1α的表达水平，其下游基因如BNIP3、VEGF和CAIX，表达水平也下降，同时，ROS的表达增加，NRF2表达减少也是TPL引发细胞凋亡的主要机制之一[5]。但TPL诱导白血病干细胞凋亡的确切机制目前尚不完全清楚。

Bcl-2是Bcl家族中抑制凋亡亚家族的典型代表，它是一种细胞原癌基因，可通过改变线粒体的通透性，抑制凋亡诱导因子的释放，从而抑制细胞凋亡[7]。本研究结果表明，雷公藤甲素下调了KG-1细胞Bcl-2蛋白的表达水平，由此推测雷公藤甲素诱导KG-1细胞凋亡的作用可能与Bcl-2的表达下降有关。β-catenin是干细胞的标志性分子之一，在白血病干细胞的自我更新与复制中发挥关键作用，介导混合系白血病干细胞的产生和耐药[8]。本实验研究显示，雷公藤甲素诱导KG-1细胞凋亡与下调β-catenin的表达有关。Akt 是原癌基因c-Akt 的表达产物，又称蛋白激酶B，在细胞凋亡、细胞增殖、细胞分化、生理代谢、衰老及疾病和癌症等细胞生理病理活动的调控中起着至关重要的作用[9]。实验表明，雷公藤甲素可抑制磷酸化Akt的表达，这一结果说明，雷公藤甲素诱导KG-1细胞凋亡与磷酸化Akt的表达下降有一定的关系。

综上所述，雷公藤甲素可以诱导急性髓细胞白血病干细胞的凋亡，其机制可能与抑制Bcl-2、β-catenin、p-AKT等蛋白的表达水平有关，但具体机制还需要进一步研究加以证实。

1 Ferrara F，Schiffer C A．Acute myeloid leukaemia in adults[J]．Lancet，2013，381（9865）：484-495．

2 Xu L Q，Li X F，Zhang Y W，et al．Effects of Chinese herbaI medicine Yiqi Huayu recipe on apoptosis of dorsal root ganglion neurons and expression of caspase-3 in rats with Iumbar nerve root compression[J]．J Chin Integr Med，2010，8（12）：1174-1179．

3 陈将华，郑维威，姜旭东，等.雷公藤甲素通过抑制逆转录病毒HERV-K Np9基因转录诱导人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡[J].南方医科大学学报，2015，12（5）：702-706.

4 El Rassi F，Arellano M．Update on optimal management of acute myeloid leukemia[J]．Clin Med Insights Oncol，2013，7：181-197．

5 Liu Y，Chen F，Wang S，et al.Low-dose triptolide in combination with idarubicin induces apoptosis in AML leukemic stem-like KG1a cell line by modulation of the intrinsic and extrinsic factors[J]. Cell Death d Dis，

2013，4：e948.

6 Lin Y. Herbal compound triptolide synergistically enhanced antitumoractivity of amino-terminal fragment of urokinase [J]. Mol Cancer，2013，12（54）：1-16.

7 Liu Q．Triptlide and its expanding multiple pharmacological functions[J]．Int Immunopharmacol，2011，11（3）：377-383．

8 Yeung J，Esposito M T，Gandillet A A，et al. beta-Catenin mediates the establishment and drug resistance of MLL leukemic stem cells [J]. Cancer Cell，2010，18（6）：606-618.

9 王秀，张竞竞，张配，等.雷公藤甲素诱导鼻咽癌细胞凋亡作用[J].中国药理学通报，2014，30（8）：1147-1150.

Mechanism of Triptolide Induced Apoptosis of Acute Myelogenous Leukemia Stem CellsZHENG

WEI-wei，LV CHANG-kun，ZHANG WEN-jing. Dept.of Laboratory Medicine，Affiliated Anhui Provincial Hospital，Anhui Medical University，Hefei，Anhui230000

Objective To study the molecular mechanisms of acute myelogenous leukemia stem cell apoptosis induced by triptolide. Methods Proliferation inhibition of triptolide to KG-1 cell was determined by MTT, IC50 concentration was calculated. According to the concentration gradient of triptolide, KG-1cells were collected to detect cell apoptosis via flow cytometry 48h after treatment. Bcl-2, beta-catenin, p-AKT and AKT proteins were detected by Western blot. Results Triptolide to KG-1 cell proliferation inhibition is in dose dependent manner and IC50 is about 4 nmmol/L, it can also induce apoptosis of KG-1 cell. Bcl-2, beta-catenin, p-AKT proteins can be down-regulated by triptolide.Conclusions Molecular mechanism of triptolide induced KG - 1 cell may be related to the Bcl-2, beta-catenin and p-AKT.

Triptolide Myeloid leukemia stem cell Apoptosis

R446.1 R733.71

A

1671-2587（2017）06-0540-03

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.06.002

*本课题受国家自然科学基金项目（No.81700154）资助

230000 合肥，安徽医科大学附属省立医院检验科（郑维威，张文静）；商丘医学高等专科学校医学技术系（吕长坤）

郑维威（1984–），男，安徽凤阳人，主管技师，博士，主要从事临床医学检验及临床血液学研究，（E-mail）379667349@qq.com。

2017-06-25）

（本文编辑：王虹）