缩骨鲫(Carassius auratus sogu var.)MC4R克隆、组织分布以及与生长相关SNPs的筛选*

杨 扬 周惠强 舒 琥① 蓝昭军 李 强 谷平华

(1.广州大学生命科学学院 广州 510006; 2.韶关市水产研究所 韶关 512006)

缩骨鲫(Carassius auratussogu var.)MC4R克隆、组织分布以及与生长相关SNPs的筛选*

杨 扬1周惠强1舒 琥1①蓝昭军2李 强1谷平华2

(1.广州大学生命科学学院 广州 510006; 2.韶关市水产研究所 韶关 512006)

黑色素皮质素受体-4 (Melanocortin reporter-4, MC4R)是G蛋白偶联受体超家族成员, 在能量调控中发挥重要作用。本实验采用同源克隆以及染色体步移对缩骨鲫(Carassius auratussogu var.)MC4R基因进行克隆, 对其核苷酸序列和推测的氨基酸序列进行生物信息学分析, 通过Real-time PCR对其mRNA组织分布进行研究, 并对缩骨鲫MC4R编码区潜在的与生长相关的SNPs进行筛选。本实验克隆MC4R基因组基因长度为2854bp, 只包含一个外显子, 长度为981bp, 共编码326个氨基酸, MC4R共有七个跨膜结构, 是较为稳定的疏水蛋白。缩骨鲫MC4R与鲫鱼的MC4R氨基酸序列的同源度最高达到 99.3%, 与 MC3R和 MC5R同源度相对其他 MCRs成员较高。缩骨鲫MC4R mRNA在脑中表达量最为显著, 眼中次之, 肌肉, 卵巢和肾脏中表达较少, 在鳃、肠、心脏和肝胰腺中微量表达。在MC4R的CDs区内检测到6个与生长潜在相关的SNPs: 两个错义突变(A199G和A881C), 4个同义突变(A123G, C231T, A444G和C480T)。本实验可为缩骨鲫生长和发育的分子机制研究以及遗传育种提供基础资料。

黑色素皮质素受体-4 (MC4R); 缩骨鲫; 克隆; 组织分布; 单核苷酸多态

黑色素皮质素受体-4 (melanocortin reporter-4,MC4R)属于黑色素皮质激素受体(melanocortin reporters)家族, 是G蛋白偶联受体超家族成员, 具有7个跨膜结构, 为典型的视紫红质受体蛋白(Jangpraiet al, 2011)。黑色素皮质素受体与其配体—阿黑皮素原 (POMC)的衍生物所组成的黑色素皮质素系统在生物体代谢调控和能量平衡中扮演着重要的角色(Ellacottet al, 2004)。MC4R是该系统中的重要组成部分, 其功能十分广泛, 与能量代谢(Ellacottet al,2004)、食物摄入(Bertileet al, 2006)、性行为(Van der Ploeget al, 2002)以及疼痛感触(Vrintenet al, 2000)均有关联。MC4R可接受多种受体, 它可以受到α-MSH的激活, 促使生物体加快代谢, 抑制进食, 抑制体重增长; 也可以受到刺鼠蛋白(agouti), 刺鼠相关蛋白(AGRP)以及神经肽 Y (NPY)的抑制, 抑制生物体代谢, 促进生物体觅食, 减缓体重降低(左北瑶等,2011)。在人类中, MC4R的突变可以引起肥胖症(Vaisseet al, 1998)。有统计显示, 有4%的肥胖患者都是由于MC4R基因突变引起的(Froguelet al, 2001)。在小鼠中敲除该基因, 小鼠表现出多食、肥胖、胰岛素分泌过多等症状(Huszaret al, 1997)。由于MC4R在能量调控中发挥的重要作用, 在疾病治疗和农业方面, MC4R受到越来越多的关注。

MC4R作为一种脑神经受体主要分布于脑中, 在其他组织内也有着不同程度的分布。MC4R的组织表达在哺乳动物和家禽有着较多的研究。Mountjoy等(1994)通过原位杂交技术对大鼠脑内MC4R的表达进行检测, 结果显示MC4R在皮质、丘脑、下丘脑、脑干和脊髓内均有表达。王婕等(2011)对鸭的MC4R基因的组织表达差异进行了分析, 结果显示, 肌肉、脂肪、心脏、肾脏、脾脏和脑中均有不同程度的表达。在鱼类中, MC4R 的组织表达在齐口裂腹鱼(Schizothorax prenati, Weiet al, 2013), 金鱼(C.auratusvar., Cerdá-Reverteret al, 2003), 虹 鳟(Oncorhynchus mykiss, Haitinaet al, 2004)和蛇皮鱼(Snakeskin gourami, Jangpraiet al, 2011)等鱼中有所研究, 均在脑中有着较高的表达。

单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性(Lander, 1996)。SNPs分布极为广泛, 平均每1000bp的基因就含有一个SNPs (Zhaoet al, 2003)。分布于基因内的SNP可能会对mRNA的表达, 翻译和剪切以及蛋白质的结构和功能造成影响, 从而导致生物体性状的改变(Carrollet al,2005)。MC4R的SNPs与生物体的性状关联分析在家畜和家禽中有着广泛的研究, 但在鱼类中罕有报道,只对吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)和红鳍东方鲀(Takifugu rubripes) MC4R的SNPs有所研究(刘福平等, 2009; 张丽等, 2012)。

缩骨鲫(C.auratussogu var.)主要分布于湖南与广东, 因其尾部脊椎萎缩而得名, 在广东有一定规模的养殖(谢楠等, 2016)。其躯体较高, 体长约为体高的1.6倍。距背鳍前基部三分之一处的后部脊椎骨呈萎缩状, 尾柄长远小于尾柄高。背鳍后基部的两侧肌肉发达。这种体型并非病态, 而是纯粹的遗传所致(俞豪祥等, 1986)。缩骨鲫肉质鲜美, 营养丰富, 但是生长较为缓慢。故以能量代谢密切相关的 MC4R作为本实验的候选基因, 对其克隆, 序列分析, 表达分布以及检测与生长潜在相关 SNPs, 为缩骨鲫生长和发育的分子机制研究以及遗传育种提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼

实验用缩骨鲫 14尾, 体质量为(106±8.7)g, 取自广东韶关水产研究所, 饲养于广州大学水产养殖室的水族箱内。

1.2 实验试剂

Ezup柱式动物基因组 DNA抽提试剂盒和SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自生物工程(上海)股份有限公司; Taq酶和 RNA keeper购自 Vazyme Biotech公司。PMD19-T、大肠杆菌 DH5α感受态、RNAiso、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)和 SYBR® Premix Ex Taq™II (Tli RNaseH Plus), ROX plus均购自TaKaRa公司。

1.3 引物设计和序列的克隆

根据鲫鱼MC4R基因设计两对CDs区域的引物(MC4R1F, MC4R1R, MC4R2F和MC4R2R)和一对3’非翻译区引物(MC4R3F和MC4R3R), 根据已扩增出缩骨鲫 MC4R片段, 设计三条染色体步移引物MC4R4、MC4R5、MC4R6和一对Real-time PCR引物(表1)。剪取25mg缩骨鲫背部肌肉, 使用生工DNA提取试剂盒抽提基因组 DNA。使用上述的引物对缩骨鲫基因组 DNA进行扩增, 纯化后, 转入大肠杆菌,送至上海美吉生物医药科技有限公司测序并使用Seqman拼接。

表1 用于缩骨鲫MC4R基因克隆、表达分析和SNPs筛选的引物Tab.1 Primers used for cloning and expression analysis of MC4R in C.auratus sogu var.

1.4 MC4R基因的序列拼接及分析

将测序获得MC4R基因片段利用DNAstar 7.1的Seqman对序列进行拼接、比对, 获得缩骨鲫 MC4R基因组基因全序列, NCBI登录号为KX988002。利用ExPASy-ProtParam tool在线分析工具分析缩骨鲫MC4R基因编码蛋白的理化性质。使用 TMHMM Server v.2.0对缩骨鲫MC4R蛋白的跨膜结构预测。使用Mega 5.0软件对已公布的部分MC4R以及MCR家族的氨基酸序列(表2)进行多重比对, 并使用NJ法构建分子系统发育树, Bootstrap检验重复1000次。

1.5 缩骨鲫MC4R的组织分布表达分析

取 3尾缩骨鲫的 9个组织: 脑、眼、心脏、卵巢、肝胰脏、肠、肾脏、鳃和肌肉迅速放入RNA keeper中, 使用trizol法提取总RNA, 使用2%琼脂糖电泳检测RNA质量。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)说明书进行反转录。该实验使用的荧光定量PCR平台是ABI7000,按照 SYBR® Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)试剂盒要求进行 Real-time PCR对 9种组织的mRNA表达量进行检测, 每一个样品设置三个重复。对PCR产物进行溶解曲线检测, 并送至上海美吉生物医药科技有限公司测序, 以确定扩增基因为目的基因。本实验使用 β-actin作为内参基因(表 1),QMC4RF和QMC4RR作为缩骨鲫MC4R 特异性引物。使用2–ΔΔct法对不同组织的相对表达量进行计算并作图。

表2 用于构建系统发育树的MC4R以及MCRs氨基酸序列Tab.2 GenBank accession numbers of MC4R and MCRs used in this study

1.6 与生长相关的SNPs的检测

在一同时孵化, 饲养条件相同的缩骨鲫群体内,选取5条较大个体和5条较小个体, 作为筛选与生长相关的 SNPs的样本, 并剪其鳍条, 提取基因组DNA。将提取的 10尾缩骨鲫基因组 DNA混合成基因池, 使用 MC4R1F、MC4R1R、MC4R2F 和 MC4R2R两对引物以该基因池为模板分别对两段 CDs进行扩增, 并送至上海美吉生物医药科技有限公司测序, 得到的结果使用Chromas 2.33查看, 筛选SNPs点, 并对SNPs位点进行初步分析。

2 结果

2.1 缩骨鲫的MC4R基因组基因获得与分析

缩骨鲫MC4R CDs以及3’非翻译区的扩增片段如图 1所示, 启动子区域通过染色体步移获得,MC4R基因组基因长度为 2854bp, 只包含一个外显子, 长度为 981bp, 共编码 326个氨基酸, 缩骨鲫MC4R序列的具体分析见图 2。推测的 MC4R蛋白预计分子量为 36531.58, 等电点为 8.45。其氨基酸组成中以亮氨酸(Leu)的含量最高(12.6%), 含量最低的是色氨酸(Trp), 为 1.5%, 其他氨基酸含量在1.8%—10.7%之间。此蛋白不稳定系数为 35.65, 是一种较为稳定的蛋白。此外, 蛋白质氨基酸残基亲疏水性总平均数(GRAVY)为–0.713, 此蛋白为疏水蛋白。

图1 缩骨鲫MC4R部分基因组序列扩增结果Fig.1 PCR result of MSTN of C.auratus sogu var.

2.2 缩骨鲫MC4R氨基酸序列的跨膜结构分析

缩骨鲫 MC4R氨基酸序列的跨膜结构使用TMHMM Server v.2.0进行分析, 结果显示, 该蛋白共有七个跨膜结构, 与其他G蛋白偶联受体相同。跨膜蛋白N-末端位于细胞膜外, C-末端位于细胞膜内七个跨膜结构的位置分别为45—67, 79—101, 121—143,163—185, 195—217, 243—265 和 280—302(图 2)。

图2 缩骨鲫MC4R核苷酸序列与推测的氨基酸序列Fig.2 MC4R nucleotide sequence and predicted amino acid sequence of C.auratus sogu var.

2.3 缩骨鲫MC4R的同源性分析

对比 GenBank中已经公布的一些物种的 MC4R和 MCRs氨基酸序列, 结果显示, 缩骨鲫与鲫鱼的MC4R氨基酸序列的同源度最高达到99.3%, 与鲤鱼的同源度次之达到98.6%, 缩骨鲫与其他鲤科鱼类的同源度为 97.9%—97.5%, 鲤科鱼类中的 MC4R非常保守。缩骨鲫与其他硬骨鱼类的同源度为 83.4%—79.7%, 与软骨鱼类赤的同源度为 75.3%, 与陆生动物的同源度为71.2%—68.9%。在MCRs家族中, 缩骨鲫MC4R与鲫鱼的MC5R最为同源, 达到68.4%。另外, 与斑马鱼的MC3R的同源度为60.5%, 与斑马鱼MC1R的同源度为42.5%, 与斑马鱼的MC2R同源度为25.7%。总而言之, MC4R在不同的物种内相对保守, MCRs家族间有着较大差异。

图3 不同物种MC4R以及MCRs家族氨基酸序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of MC4R of different species and MCRs family

2.4 缩骨鲫MC4R在不同组织的转录表达分布

通过Real-time PCR对缩骨鲫MC4R在不同组织内的表达量研究。Real-time PCR的扩增产物溶解曲线为单峰, 测序结果确认扩增产物为目的片段。Real-time PCR结果表明, 在缩骨鲫脑中MC4R中含量最高, 眼中次之, 肌肉, 卵巢和肾脏中表达较少,在鳃、肠、心脏和肝胰腺中微量表达(图4)。

2.5 缩骨鲫MC4R编码区SNPs检测

在缩骨鲫的CDs区域中, 有6个SNPs被检测到(图2), 以编码区第1个核苷酸为1, 编码区下游为正值, 对 SNPs进行命名, 分别为 A123G、A199G、C231T、A444G、C480T和A881C(图5), A123G位同义突变(CTA＞CTG), 均编码亮氨酸; A199G为错义突变(ATC＞GTC), 分别编码异亮氨酸和缬氨酸, 均为非极性氨基酸, 该突变位于第一个跨膜结构内; C231T为同义突变(TAC＞TAT), 均编码酪氨酸; A444G为同义突变(ACG＞ACA), 均编码苏氨酸; C480T为同义突变(ACT＞ACC), 均编码苏氨酸, A881C位错义突变(CAC＞CAA), 分别编码组氨酸和谷氨酰胺, 位于第四个细胞外结构区。这些突变均可能对缩骨鲫的生长数量性状造成影响。

图4 缩骨鲫MC4R mRNA在不同组织内的表达Fig.4 Relative expression of MC4R mRNA in tissues of in C.auratus sogu var.

图5 缩骨鲫MC4R编码区的SNPs位点Fig.5 The SNPs in CDs of C.auratus sogu var.

3 讨论

缩骨鲫MC4R与部分GenBank公布MC4R的序列和MCRs家族成员比对显示, 缩骨鲫与鲫鱼的同源性最高达到 99.3%, 这与刘良国等(2005)采用 RAPD方法分析鲫鱼品系所得出的结果相符: 缩骨鲫可能是由普通鲫鱼分化而来。鲤科鱼类中, MC4R的同源度都很高, 可达 97.5%—99.3%, 这意味着 MC4R在生理调控方面可能有着重要作用。MC4R与其他MCR家族成员同源度为 25.7%—68.4%, 其中, MC4R与MC3R和MC5R的同源度相对其他MCRs成员较高,分别为 68.4%和 60.5%, 有报道称这三个黑色素皮质素受体在功能上有所重叠(Shuklaet al, 2013), 这可能是由于MC4R与MC5R和MC3R相对于其他MCR家族成员分化时间较短有关。另外, Klovins等(2004)的实验结果显示在白斑角鲨(Squalus acanthias)中,MC4R与MC3R和MC5R的同源度相对于其他MCRs成员也是最高的, 本实验结果与其相符。多重比对显示, 鱼类中的MC4R与陆生动物有着较大的差异, 鱼类 MC4R氨基酸长度多为 326—327aa, 但是陆生动物中MC4R氨基酸残基长度一般332aa左右。另外,通过 MC4R氨基酸序列构建的分子系统发育树与形态学的系统分类结果基本吻合。

缩骨鲫的 MC4R mRNA表达主要分布于脑中,在肌肉, 肾脏, 眼和卵巢中也有不同程度的分布, 在鳃, 肝胰腺, 肠和心脏中微量表达。缩骨鲫在脑, 肌肉, 肾脏, 眼和卵巢中的表达与蛇皮鱼较为相似(Jangpraiet al, 2011); 在金鱼中, MC4R在脑, 眼和性腺中同样有着显著的分布(Cerdá-Reverteret al,2003)。在虹鳟中, MC4R也主要集中于脑, 肾脏和性腺中表达, 但在肌肉中表达较少, 与缩骨鲫相异。MC4R作为一种中枢神经受体, 故而在脑中有着较高的表达(Ellacottet al, 2004); MC4R与性行为有着密切的关联, 这可能是 MC4R在性腺中有着显著的表达的原因(Lhet al, 2002); MC4R在肾中的显著表达,可能与肾脏是重要的调节能量平衡的器官并且肾脏中有着POMC衍生物的存在有关(Bertileet al, 2006)。有报道称 MC4R存在于肌肉中, 可能与代谢调节有关(刘欣等, 2012), 但是其对肌肉及其周围组织的作用尚不清楚。

本实验共发现位于缩骨鲫 MC4R编码区上的 6个SNPs, 其中四个同义突变, 两个错义突变, 在很多研究中, 同义突变同样会影响生物体的生长性状, 这主要是因为同义突变可能会改变蛋白的折叠空间结构, 导致蛋白的功能发生变化(Kimchi-Sarfatyet al,2007), 这在多种动物中均有报道(刘德武等, 2008;付金秀等, 2016)。Komar(2007)也认为只有少数的同义突变属于中性突变, 大部分的同义突变会对个体造成影响。A199G为错义突变(ATC＞GTC), 分别编码异亮氨酸和缬氨酸, 但均为非极性疏水氨基酸, 这种变化并不会对该蛋白造成致命的影响, 但是很有可能影响缩骨鲫的性状。A881C 为错义突变(CAC＞CAA), 分别编码组氨酸和谷氨酰胺, 位于第四个细胞外结构区, 两个氨基酸均为极性氨基酸, 同样不是致命的, 但是否对缩骨鲫的个体性状有影响,还需要大规模的群体进行SNPs与性状的关联分析。

4 结论

本文采用同源克隆及染色体步移对缩骨鲫MC4R基因进行了克隆, 得到了缩骨鲫MC4R的基因序列长度为 2854bp, 只包含一个外显子, 长度为981bp, 共编码326个氨基酸, MC4R共有七个跨膜结构, 是较为稳定的疏水蛋白。该基因与其他鱼类相比具有较高的同源度, 但与陆生动物的同源度相对较低。缩骨鲫MC4R mRNA在脑中表达量最为显著, 眼中次之, 肌肉、卵巢和肾脏中表达较少, 在鳃、肠、心脏和肝胰腺中仅微量表达。另外还发现了位于编码区上的6个潜在的与生长性状相关联的SNP位点。本实验可为研究缩骨鲫的生长和发育的调控机制以及分子辅助育种提供基础资料和理论依据。

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CLONE, EXPRESSION, AND SCREENING OF GROWTH ASSOCIATED SNPS OFCARASSIUS AURATUSSOGU VAR.

YANG Yang1, ZHOU Hui-Qiang1, SHU Hu1, LAN Zhao-Jun2, LI Qiang1, GU Ping-Hua2
(1.School of Life Science,Guangzhou University,Guangzhou510006,China;2.Shaoguan Fisheries Research Institute,Shaoguan512006,China)

Melanocortin reporter-4 (MC4R) belongs to G-protein-coupled receptors family; it plays an important role in energy regulation.By homologous cloning and chromosome walking, MC4R gene ofCarassius auratussogu var.was cloned, and the expression of MC4R gene were studied based on real-time PCR.Meanwhile, SNPs (single nucleotide polymorphisms) of the MC4R in CDs region were detected by Sanger sequences.The result show that the length of MC4R genome gene was 2854bp that contain one 981-bp exon, the CDs code 326 amino acid.The MC4R contained 7 transmembrane structure and was a stable hydrophobin.Through sequence alignment of MC4Rs from different species and other members of MCRs, we found that theC.auratusis the closest species toC.auratussogu var.The homology ratio is 99.3%, the MC4R was far from other MCRs members.The real-time PCR result shows that MC4R mRNA was most expressed in brain, and then in eyes; and less expressed in muscle, ovary, and kidney.Weak MC4R mRNA was expressed in gill, intestine, heart and hepatopancreas.In the codon sequence, six SNPs were detected: two missense mutations, and four silent mutations.The results shall be insightful to understand the growth ofC.auratussogu var., and offer fundamental data for molecular markers ofC.auratussogu var.

melanocortin reporter-4 (MC4R);Carassius auratussogu var.; clone; tissue expression; single nucleotide polymorphisms (SNPs)

Q953; S917.4

10.11693/hyhz20170100025

* 国家公益性行业(农业)重大专项, 201303048号; 广东省自然科学基金项目, 2015A0303135092号; 广东省科技计划项目,2014A020208145号。杨 扬, E-mail: 214453598@qq.com

① 通讯作者: 舒 琥, 博士, 教授, E-mail: shuhu001@126.com

2017-01-29, 收修改稿日期: 2017-03-04