盐胁迫条件下花生转录因子表达分析

赵小波，闫彩霞，李春娟，王 娟，姜常松，单世华*

(1. 山东省花生研究所，山东 青岛 266100； 2. 山东海阳市农技站，山东 海阳 265100)

盐胁迫条件下花生转录因子表达分析

赵小波1，闫彩霞1，李春娟1，王 娟1，姜常松2*，单世华1*

(1. 山东省花生研究所，山东 青岛 266100； 2. 山东海阳市农技站，山东 海阳 265100)

花生是重要的油料与经济作物，花生耐盐机制的研究对于盐碱地的开发有潜在重要意义。本研究以花生耐盐品种A025为研究对象，利用转录组测序技术分析了盐胁迫条件下，花生转录因子的表达情况，共计发现33个转录因子家族，包括102个上调表达与38个下调表达转录因子，大量差异表达转录因子集中在MYB，NAC与WRKY三个家族。本研究结果可为筛选新的耐盐花生种质提供理论依据。

花生；转录因子；盐胁迫；转录组

花生(ArachishypogaeaL.)是世界四大油料作物之一，在100多个国家广泛种植，主要分布在亚洲、非洲和美洲地区。我国是世界花生生产大国，占世界花生总产的40%以上，居世界第一位[1]。随着我国经济水平的持续发展，人们生活水平不断提高，对花生及其制品需求量也出现了持续增加的局面，因而提高花生产量势在必行。但随着人口的增加，粮油争地矛盾日益突出，如何开发和利用盐渍化土地资源具有重要意义[2]。

根据联合国有关组织的不完全统计，我国盐渍土地面积约为35～37Mhm2，占世界盐碱地的1/28，占我国可耕作土壤的1/4，且主要集中在我国干旱和半干旱地区。土壤盐碱问题严重制约着我国农业的发展。随着科学技术日新月异的发展，研究人员利用分子生物学技术对植物耐盐性进行了大量研究。但是，耐盐性是一个多基因控制的性状，虽然对花生在盐胁迫条件下的生理生化变化有了比较广泛的研究，但是相关的分子机制仍然主要来自少数独立基因的研究，难以获得系统的生物遗传信息。转录组学相关技术的发展，使得系统研究植物逆境胁迫相关分子机制成为可能。

转录因子在植物对逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用，当植物受到逆境胁迫时，转录因子会与相应的顺式作用元件结合，启动相应基因的转录表达，调控一系列的分子响应机制从而减轻逆境胁迫给植物带来的伤害[3]。目前，利用转录组相关技术发现许多转录因子在盐胁迫条件下可以诱导表达。Jiang和Deyholos 等[4]利用微阵列技术分析盐胁迫下拟南芥转录组的变化, 发现在盐胁迫条件处理下，289个转录因子上调表达，139个转录因子下调表达。Ma等[5]在拟南芥中发现的仅被或主要被盐胁迫诱导而上调表达的基因中，20%是转录因子。Seki等[6]在拟南芥中鉴定出15个被高盐诱导的转录因子。这些被盐胁迫诱导表达的转录因子与植物对盐胁迫的适应性之间具有密切关系。

2016年花生野生基因组的公布[7]使得更加精确地研究花生耐盐转录因子成为可能。在本研究中，利用RNA-Seq技术分析了盐胁迫处理后花生转录因子表达的变化，为深入研究花生耐盐分子机制乃至培育耐盐花生种质提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 花生幼苗培养与测序

表1 荧光定量PCR所需引物

以鉴选出[8]的花生品种A025(耐盐)为研究对象。加Hoagland氏培养液于28℃，湿度60%，光照强度500 μmol·m-2·s-1条件下培养。种子培养20d后，于200mmol/L NaCl溶液分别处理0、2、4、6、8、12h后取其根部组织，混合样品液氮冷冻后保存于-80℃冰箱以备提取RNA用[9]。以0h样品为对照，三次重复。

使用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒(Takara，大连宝生物)提取根部RNA，样品随即送至广州基迪奥生物技术公司利用Illumina Hiseq 4000平台进行转录组测序。参考基因组采用NCBI以及PEANUTBASE (https://peanutbase.org/)数据。

差异基因的筛选标准设置为log2>1，并且pvalue <0.05。参考数据库为NCBI (Nt)、ProFITS(http://bioinfo.cau.edu.cn/ProFITSArF.php)以及Plant TF database (http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/download.php)。

1.2 荧光定量PCR分析

利用荧光定量PCR技术检测14个转录因子在不同盐胁迫处理时间点的表达量，以检验转录组测序的可靠性。应用Beacon Designer 7.0 软件(Premier Biosoft, USA)设计荧光定量PCR引物。Actin基因作为内参基因[10]，依据前述方法与设置，提取花生盐胁迫的根部RNA。使用7500 FAST荧光定量PCR仪(ABI公司)分析14个转录因子的相对表达情况。反应条件为 95℃ 10s；95℃ 5s，60℃ 30s，72℃ 10s，40个循环；绘制溶解曲线，温度每10s升高0.5℃。3次重复。

相对表达量的计算采用2-ΔΔCT方法[11]，实验数据采用SPSS 12.0分析(SPSS Inc., Chicago, USA)。荧光定量PCR所需引物见表1。

2 结果与分析

实验结果表明(附图)，荧光定量PCR所展示的数据趋势与转录组测序的趋势一致，从而验证了转录组测序结果的可靠性。

转录组测序分析结果中，共获取了51081个基因，其中新基因2327个，对照组获得51006个基因，新基因2331个。与对照组基因表达对比，发现共10788个基因表达发生变化，其中4552个基因的表达上升，6236个基因的表达下调。分析差异表达转录因子，共计发现33个转录因子家族，包括102个上调表达与38个下调表达转录因子(表2)。其中，FAR1等14个转录因子家族全部上调表达。大量差异表达转录因子集中在MYB，NAC与WRKY三个家族，各有18、11、11个差异表达转录因子。

附图 盐胁迫环境下14个差异表达转录因子在不同时间点的相对表达量 Fig. 14 TFs gene expression at different time response to salt stress 注：纵轴代表相对表达量，横轴代表不同时间点。a: 上调表达；b: 下调表达。 Note: The Y-axis represents relative expression level. The X-axis represents different time (h). a: up-regulated expression; b: down-regulated expression.

表2 差异表达转录因子总结

基因家族Genefamily上调表达Up⁃regulatedexpression下调表达Down⁃regulatedexpressionb⁃ZIPabscisicacidresponsiveelement⁃bindingfactor1(Aradu．A9N6H)；TGA1⁃B(Aradu．AA2QE)；bZIP131(Araip．5T5JE)；bZIP122(Araip．64P0C)RF2b(Araip．0GM4I)；bZIP61(Aradu．7CE6B)；bZIP34(Aradu．YM0TI)C2H2WIP2(Aradu．8HA7W)；TESTA1(Araip．Z9NFP)；zinc⁃fingerprotein3(Araip．7JY4Q)；zinc⁃fingerprotein2(Araip．Y6XIC)；methyl⁃CPG⁃bindingdomain8(Aradu．6GZ9E)；JACKDAW(Aradu．BWJ69)；MAGPIE(Araip．IQ0PD)；C2H2like(Araip．R6M68)M⁃typeAGL80(Aradu．8KH6E)TrihelixGT⁃3b(Araip．HW40V)；GT⁃2(Aradu．A9Z84)；ribonucleaseJ(Aradu．859SE)LOBLOB25(Aradu．PJ3BC)；LOB41(Araip．I7PN0)LOB4(Araip．ZWZ8M)HSFheatshocktranscriptionfactorA2(Araip．DCD5Q)；heatshocktranscriptionfactorB4(Aradu．NTQ7W)G2⁃likeAPRR2(Araip．Q9PAY)NF⁃YBnuclearfactorY，subunitB3(Araip．92GX5)NF⁃YAYsubunitA⁃3⁃like(Aradu．0KQ9H)；YsubunitA⁃1⁃like(Araip．RA93N)；YsubunitA⁃7(Aradu．V66GG)SBPSBP12(Araip．QT8AK)；SBP1(Aradu．LNZ6T)；squamosapromoter⁃binding⁃likeprotein12(Araip．0ZF73)squamosapromoterbindingprotein⁃like5(Araip．N9DIE)BES1BES1/BZR1homolog2(Araip．C7RCE)TALEBEL1⁃likehomeodomainprotein9(Aradu．49B5R)；BEL1⁃likehomeodomainprotein3(Aradu．9ND07)BEL1⁃likehomeodomainprotein1(Araip．69GAG)；HB⁃otherhomeobox⁃leucinezipperproteinANTHOCYANINLESS2(Aradu．4HB9F)SRSLATERALROOTPRIMORDIUM1(Araip．PUB53)B3Auxinresponsefactor23(Araip．45RHI)；Auxinresponsefactor18(Aradu．05DT4)；REM16(Aradu．0TU0Y)；Auxinresponsefactor2(Aradu．4WT7F)At3g18960(Aradu．TKK2L)；AUXIN16(Araip．6W0QH)AP2At2g41710(Araip．6J28H)CAMTAcalmodulin⁃bindingtranscriptionactivator4(Aradu．VI57J)C3HCCCHdomain⁃containingprotein31(Araip．BAN8Q)C⁃x8⁃C⁃x5⁃C⁃x3⁃H(Aradu．HQ3MZ)HB⁃PHDpathogenesis⁃relatedhomeodomainprotein(Aradu．ED224)Nin⁃likeNLP4(Aradu．7K2S3)YABBYYABBY1(Aradu．NH6FA)；YABBY4(Araip．MGE63)

3 讨 论

研究中发现一些转录因子家族全部上调表达，例如FAR1家族(FAR1-12;FAR1-5;FAR1-11)。FAR1基因家族作为正调控因子在phyA信号通路发挥作用。在接下来的研究中发现，该家族含有一个与玉米Mutator家族的转座酶MuRA[12]以及转座酶Jittery相似的序列[13]。作为一个起源进化于转座子的基因新家族，FAR1能够稳定地存在于拟南芥基因组中，且没有检测到显著的末端反向重复序列(TIR)和其他的转座子类似结构[12]。FAR1的结构包括N端C2H2锌指结构域，中部推测的转座子核心结构域以及C端SWIM锌指结构域。其中N端C2H2结构域具有DNA结合活性，C端结构域具有转录激活活性。基于这种进化过程，FAR1成为了一种新型的转录因子，能够特异地识别FBS(FHY3-binding motif，CACGCGC)顺式作用元件[14]，因此能够与启动子上含有FBS序列的基因特异性结合，调控它们的表达，行使生物学功能。到目前为止，花生中FAR1基因的研究报道较少。推测该转录因子家族在花生抗逆，尤其是耐盐机制中可能具有重要作用，应该是下一步研究的重点。

大量上调表达转录因子集中在MYB，NAC与WRKY三个家族。MYB家族的成员能对逆境胁迫及激素产生应答。现有研究表明MYB转录因子在植物耐盐调控网络中发挥重要作用。MYB转录因子通过ABA 信号途径参与的耐盐抗旱调控与植物中的其他信号转导途径存在着不同程度的交叉，如具有多重调节作用的R2R3-MYB转录因子AtMYB41，它不仅可对ABA、干旱、盐和冷等刺激作出应答，还可影响细胞及角质层的发育，表明其在调控非生物胁迫和细胞壁发育之间存在功能交叉[15]。在A.duranensis(花生A亚基因组)中存在112个该类基因，而在B亚基因组中发现了120个。在本项研究中，13个MYB转录因子上调表达，5个下调表达。在水稻中的研究发现，盐胁迫响应转录因子OsMPS具有调控植物激素和细胞壁合成的功能，该转录因子的表达可受ABA、细胞分裂素(CK)、赤霉素(GA) 和油菜素内酯等多种植物激素的诱导。由此看出，MYB转录因子参与的调控植物细胞壁形成的多条激素信号合成途径在增强植物耐盐抗旱中同样发挥着重要作用[16]。

NAC转录因子在植物体内具有多重角色，参与植物干旱和高盐等非生物胁迫适应。对普通小麦在盐胁迫后的转录组进行分析，发现53个NAC基因中有23个NAC基因在对盐胁迫的应答中为上调表达[17]。在本研究中11个差异表达的NAC基因中，有9个为上调表达。此外，NAC家族还在高盐胁迫条件下通过miRNA抑制相应mRNAs的表达来进行调控，是植物重要的抗逆基因家族[18]。

WRKY类转录因子是植物中特有的转录调控因子，其N端含有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列[19]。 WRKY转录因子调节植物从发育到各种生物和非生物胁迫以及激素介导的信号通路过程。目前发现WRKY转录因子在发挥植物耐盐抗旱作用时主要与植物激素ABA信号通路、病原体防御通路以及ROS等多条信号通路存在交叉作用。如在拟南芥中过表达WRKY25和WRKY33后，其耐盐性和ABA敏感性增强[20]；在本研究中，除去WRKY4转录因子，其余的差异表达WRKY基因均为上调表达，暗示了其在花生耐盐分子机制中的重要作用。

现有研究表明，转录因子调控植物分子抗逆机制是一个极其复杂的动态网络，其中包括整合以及协同竞争作用。下一步的工作应该是在这个动态网络中探明不同转录因子的精准角色，从而使通过基因工程手段充分利用转录因子提高植物的抗逆性发挥更强大的作用。

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DifferentialExpressionofTranscriptionFactorFamiliesinPeanutunderSaltStress

ZHAO Xiao-bo1, YAN Cai-xia1, LI Chun-juan1, WANG Juan1, JIANG Chang-song2*, SHAN Shi-hua1*

(1.ShandongPeanutResearchInstitute,Qingdao266100,China; 2.HaiyangAgriculturalTechnologyExtensionStation,Haiyang265100,China)

Peanut (ArachishypogaeaL.) is an important crop which is affected by salt stress. The study of salt tolerance in peanut is important for the exploitation of saline soil. Transcription factors (TFs) play central roles in salt tolerance responses in peanut. In this study, we analyzed the differential expression of TFs in response to salt stress in the salt-resistant peanut cultivar A025 by RNA-seq. We identified 140 differentially expressed TFs based on transcription data, among which 102 were up-regulated and 38 were down-regulated. MYB, NAC and WRKY were the most highly enriched TF families. This study provided theoretical basis for the screening of salt resistant germplasms of peanut.

peanut; TFs; salt stress; RNA-seq

10.14001/j.issn.1002-4093.2017.03.009

S565.2; Q786

A

2016-07-07

山东省自然科学基金(ZR2016CP03)；国家国际科技合作专项(2015DFA31190)；山东省现代农业产业技术体系花生遗传育种岗位(SDAIT-04-02)；花生抗逆、广适种质资源创新与利用项目(山东省农业良种工程)；国家科技支撑计划(2014BAD11B04)；山东省农业科学院农业科技创新工程项目(CXGC2016B02)；“十二五”国家科技支撑计划项目(2014BAD11B04)

赵小波(1984-)，男，山东青岛人，山东省花生研究所助理研究员，博士，主要从事花生遗传育种研究。

*通讯作者：单世华，研究员，博士，主要从事花生种质资源与育种研究。E-mail: shhshan@sina.com 姜常松，高级农艺师，主要从事农业技术推广工作。E-mail: hynjz-908@163.com