SSR分子标记在梨遗传育种研究中的应用

冯章丽，刘畅，顾广军，程显敏，刘延杰，卜海东，于文全

(黑龙江省农业科学院牡丹江分院，黑龙江 牡丹江 157041)

SSR分子标记在梨遗传育种研究中的应用

冯章丽，刘畅，顾广军，程显敏，刘延杰，卜海东，于文全*

(黑龙江省农业科学院牡丹江分院，黑龙江 牡丹江 157041)

对SSR分子标记在梨的品种鉴定，种质资源评价，重要农艺性状的基因定位以及分子标记辅助选择育种等4个方面的研究应用进展进行了综述，并对当前SSR标记在梨研究中存在的主要问题和应用前景进行了分析，旨在为开展梨分子遗传育种提供参考。

SSR；梨；遗传育种；应用

梨属于蔷薇科(Rosaceae)梨亚科(Pomoideae)梨属 (Pyrus) 多年生果树。我国梨属于东方梨(Oriental pears or Asian pears)种群，包含有13个种，是世界梨属植物最主要的起源地之一，有着丰富的梨属资源[1-2]。为了更好的利用和评价梨属资源，多年来研究者们采用形态学，细胞学和同工酶标记等方法对我国梨属植物在分类学，亲缘关系以及品种选育研究等方面进行了研究，并取得了阶段性的进展。近年来，随着分子生物学的快速发展，利用分子标记技术为梨属植物的系统关系和品种亲缘关系的研究提供了新的手段。至今为止，前人已经利用了SSR[3-7]，ISSR[8-9]，RFLP[10]，RAPD[11]，SRAP[12]以及AFLP[4,13]等分子标记对梨资源开展了相关研究。SSR标记作为最常用的分子标记之一，由于其具有数量多，共显性，重复性好以及易操作等优点受到众多研究者的青睐。目前，SSR标记已广泛应用在梨资源的品种资源鉴定，遗传基础评价，重要农艺性状的基因定位以及分子辅助育种等多个方面，但由于SSR标记技术在梨属资源中的研究应用起步较晚，相关研究有待于更深入的开展和丰富完善。基于此，本文总结了近年来利用SSR标记技术在梨资源研究中的应用及相关研究进展，旨在为更好的利用SSR标记进行梨品种的遗传育种研究提供参考。

1 SSR分子标记

1.1 SSR分子标记原理

SSR(简单重复序列，simple sequence repeats)分子标记又称微卫星标记，由Moore等于1991年创立，是当今生物学研究中最常用的分子标记之一[14]。通常，SSR标记是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。SSR标记的原理是基于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，而微卫星中重复单位的数量又存在高度变异，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段进行克隆和测序，再根据微卫星的侧翼序列人工设计合成引物，最终实现对微卫星重复单位进行PCR扩增，扩增检测出存在差异的微卫星位点。由于个体的扩增产物在长度上的变化而产生碱基长度的多态性，这就是简单序列重复长度多态性，即所谓的SSR扩增多态性。

1.2 SSR标记特点

研究发现，SSR标记广泛随机的分布于真核生物中，大约每隔10～50 kb就有1个SSR[15]。与其它分子标记相比，SSR标记具有这样的几个特点：(1)SSR标记在全基因组上具有数量丰富，覆盖广；(2)SSR标记具有多等位基因的特性，多态性高，提供的信息量高；(3)SSR标记是以孟德尔方式遗传，呈共显性，可有效鉴别出基因的纯/杂合位点；(4)SSR每个位点由设计的引物顺序决定，其重演性好，操作简单，费用低；(5)SSR位点两侧的序列高度保守，设计合成的SSR引物通用性高；(6)SSR标记对DNA的要求不高，需要的DNA量少，易于进行PCR检测，且适合于开展高通量分析[16-17]。

2 SSR分子标记在梨品种鉴定中的应用

由于SSR标记是呈共显性标记，利用SSR标记检测亲本材料间位点的差异，就可以有效的将亲本与杂交种区分开。同时，基于SSR标记具有多态性高，重演性好以及易于操作检测等优点，已被公认为是植物新品种保护最广泛应用的标记体系，目前已经广泛用于DNA指纹图谱的构建中[18]。至今为止，SSR技术已在梨品种资源鉴定中得到了大量的应用。

Sawamura等[19]利用S-RNase等位基因和18个SSR标记对55份日本梨材料成功进行了亲本后代血缘关系鉴定。Kimura等[20]利用9个SSR标记鉴别6个种60个亚洲梨，研究表明其中7个SSR标记能将58个品种区分开。Yamamoto等[21]利用苹果SSR标记鉴定包括19个日本梨，7个中国梨，5个欧洲梨，3个野生品种以及2个杂交品种的36个梨品种资源。结果表明，参试材料除突变体外，均可在检测到的79个等位基因位点上相互鉴别开来。此外，在构建梨指纹图谱方面，薛华柏等[7]利用SSR特征指纹数据，构建了29个梨品种SSR特征指纹数据表，它可以直观有效的对品质进行区分鉴定。张靖国等[22]以20个梨栽培品种为例，利用SSR标记构建梨分子身份证体系，根据引物对不同品种扩增条带大小进行编码，然后将每个品种17个SSR位点的赋值依次组合，建立了20个梨栽培品种的分子身份证。高源等[23]利用10对SSR荧光标记引物，构建了中国建国后选育的92个梨品种的指纹图谱，选择2～3对引物就可以区别不同品种。由此可见，SSR标记用于梨属资源鉴定，具有多态性高，分辨能力强的特点，在今后开展梨品种资源保护和指纹图谱构建中具有重要的应用价值。

3 SSR分子标记在梨遗传多样性评价中的应用

遗传多样性是种质资源评价的重要指标，前人利用SSR分子标记对梨属资源的遗传多样性进行了相关研究。曹玉芬等[3]利用SSR技术对梨 41个栽培品种进行遗传多样性分析，结果表明，12对 SSR引物扩增出 114个等位基因，平均每个位点9.5个，位点杂合度在 0.1517～0.7079之间，遗传多样性指数为0.4630。蔡丹英等[4]采用10对苹果和3对梨上的SSR引物对来自温岭和丽水的18个地方梨品种类型进行了鉴定分析，结果表13对SSR引物的观察杂和度(He)为0.056～0.944，平均值为0.57，而香农指数(I)的范围0.340～2.013，平均值为 1.22。刘清文等[24]利用覆盖梨全基因组的134个SSR标记对45份西洋梨品种资源进行遗传多样性和群体结构分析，共检测到673个等位基因，每个SSR位点平均扩增5.02个，45份参试西洋梨品种的观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)以及Shannon信息指数(I)平均值分别为5.02、3.84、0.73、0.72和1.42。在梨属资源的亲缘关系鉴定上，曹玉芬等[3]利用系统聚类分析将41个参试梨品种分为西洋梨和东方梨两大类。张东等[25]利用SSR标记技术对29个砂梨品种的亲缘关系进行了分析，并进一步通过聚类分析将29个砂梨品种分成4个组。Teng等[26]研究表明，中国长江流域的野生砂梨可能是中国砂梨和日本梨系统的共同祖先。Cao等[27]和Tian等[28]对亚洲梨进行SSR标记分析，认为原产中国的白梨，砂梨品种和日本砂梨品种相互交错，并且一些日本梨与中国砂梨亲和力较高，表明中国砂梨和日本梨具有很近的亲缘关系。此外，SSR标记已经利用到梨核心种质资源圃的构建中，这对于梨属资源的收集保存也具有重要意义。卜海东等[29]利用梨资源的表型性状和 SSR分子标记相结合的方式，对寒地果树资源圃的201份梨资源进行核心种质构建研究，确定了36份资源为该圃的核心种质资源，为寒地梨育种资源多样性保护奠定了提供了保障。

4 SSR分子标记在梨重要农艺性状的基因定位中的应用

至今为止，SSR标记已经广泛应用与梨资源的遗传图谱构建和基因定位研究中。前人已经利用不同的材料构建了多张梨分子遗传图谱，这为梨资源的重要数量性状基因定位奠定了基础。Yamamoto等[30]在2002年利用SSR分子标记构建了63株Bartlett×Hosui杂交F1的分子遗传图谱。韩明丽等[31]利用八月红梨和砀山酥梨杂交得到的F1代实生苗为作图群体构建了一张包含有63个SSR标记的分子遗传图谱。崔海荣[32]通过开发砂梨的SSR标记，结合EST-SSR和RAPD两种标记，构建了砂梨“西子红/喜水”F1群体的遗传连锁图谱，并利用BSA法筛选出控制砂梨褐皮性状的分子标记CH05902，最终确定该标记与控制褐色性状位点的遗传距离是4.6cM。田义轲等[33]以矮化梨与茌梨的F1 杂交分离群体为材料，利用BSA法，通过对40对SSR引物的筛选，获得了一个与PcDw基因连锁距离为9.3cM 的SSR标记KA14210，由此将该基因定位到了梨品种‘Barlett’遗传图谱的第16连锁群上。Wang等[34]在第16连锁群上的51对SSR引物中筛选到一个与PcDw基因连锁距离仅0.9 cM 的SSR标记TsuENH022。宋伟等[35]以梨品种“黄金”和“砀山酥”的F1代杂交分离群体为试材，用分离群体分组分析法，获得了与梨果实褐皮性状相连锁的SSR 标记CH01c06 和Hi20b03，遗传连锁距离分别为4. 8 cM 和12. 0 cM。刘金义等[36]利用225对源自梨和苹果基因组的SSR引物，结合分离群体分离分析法和选择基因型分析法，对酸/低酸性状进行群体分离分析，结果表明，标记KU10 与果实酸/低酸性状连锁，遗传距离为12.15cM，并由此将果实酸/低酸性状的QTL 初步定位到梨遗传图谱的第2 连锁群上。Pierantoni 等[37]利用AFLP 和SSR标记采用区间作图法进行了梨黑星病抗性QTL分析和定位，共检测到3个梨黑星病抗性QTL位点，定位在母本图谱的第3和第7连锁群上，其最高贡献率高达87.1%。Wu 等[38]利用SNP和SSR标记对梨果实性状进行QTL定位分析，共发现与花梗长度、单果重、果实纵径、横径和可溶固形物5个性状相关的14个QTL位点，分布在第 2、3、5、10、11、13、14 和 17 连锁群，其贡献率范围为14%～30%。

5 SSR分子标记在梨分子标记辅助选择育种中的应用

分子标记辅助选择育种是将现代分子生物学与传统遗传育种学有机的结合起来，从而提高选择效率和准确性，缩短育种年限，实现产量、品质和抗性等综合性状的高效改良。刘金义等[36]定位了一个SSR标记KU10与果实酸/低酸性状连锁，为进一步开展梨果实酸/低酸性状分子辅助育种奠定了基础。宋伟等[39]利用“矮化梨”×(“茌梨”+“新高梨”)的F1代分离群体供试材料，通过对281对分别源自苹果和梨基因组的SSR引物的BSA 筛选与群体分析，获得了与梨果实形状相关的SSR标记CH02b10 和CH02f06，其对圆形/非圆形性状判断的符合率分别为91. 67% 和96. 67%。此外，Evans 等[40]在梨第17连锁群上发现了2 个与梨棉蚜抗性基因紧密连锁的SSR标记NH006b 和NH014a，利用此标记可进行梨棉蚜抗性检测。2011年，Wang等[34]筛选到一个SSR 标记TsuENH022，它与PcDw基因连锁距离仅0.9 cM，这也是到目前为止与梨所有农艺性状基因遗传距离最近的标记，可以用来进行梨矮化性状的标记辅助选择育种。目前，虽然SSR已应用于梨的辅助选择育种研究，但由于现有的与目标性状紧密连锁的遗传标记很少，所以有待于开发合成新的SSR标记，构建新的高密度遗传图谱，定位出距离各连锁群更近的基因，以提高标记选择的高效性和准确性。

6 SSR分子标记在梨研究中存在的问题及应用前景分析

由于梨树为多年生植物，且基因型高度杂合，遗传背景十分复杂，这些均给梨育种研究带来困难。传统育种往往根据表型选择，盲目性较大，利用SSR分子标记技术能够从DNA水平上有效的进行阐述，是梨辅助遗传育种研究的有力手段，能够大大加快梨育种进程，提高品种选育效率。目前来看，SSR标记在梨研究中主要存在这样的3个方面的问题：(1)由于SSR标记在梨研究中的应用起步较晚，尽管当前已经构建了许多梨资源的分子遗传图谱，但真正可以应用于分子辅助育种的却很少。(2)从梨属植物基因组中开发出的SSR引物较少，检测的SSR位点数不足，尚未完全覆盖整个梨的基因组，且许多SSR引物的检测效果不好。据文献报道，目前超过500对引物能用于梨上，主要有梨的240对，苹果的200对以及桃和甜樱桃的65对，但利用频率高，且效果的好的SSR引物有62对[41](表1)。(3)SSR标记单独无法准确有效的区分芽变品种和原品种。

表1 62对梨高效SSR引物

近年来，随着分子生物学和生物信息学的快速发展，梨分子标记的研究已取得实质性进展。相信未来会有越来越多的梨SSR分子标记被开发和利用起来，这必将进一步促进梨遗传图谱的构建和重要农艺性状基因的定位和克隆，最终为实现梨分子标记辅助育种奠定基础。

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ApplicationofSSRMolecularMarkerinPearGeneticsandBreedingResearch

Feng Zhangli,Liu Chang,Gu Guangjun,Cheng Xianmin,Liu Yanjie,Bu Haidong,Yu Wenquan

(Mudanjiang Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Mudanjiang,Heilongjiang 157041)

We summarized the application of SSR molecular markers in pear cultivars,including identification of pear variety,diversity of germplasm resources evaluation,gene mapping of important agronomic traits and marker-assisted selection breeding four aspects,and further analyzed the current main problems of SSR markers research and application prospects in the pear. The aim is to provide references for developing pear molecular genetic breeding in future.

SSR; Pear;Genetics and breeding; Application

2017-06-09

现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-28)

冯章丽(1984-)，女，助理研究员，硕士，主要从事寒地果树育种研究，E-mail：ffzzl-0319@163.com;*通讯作者：于文全。

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.06.032

S661.2

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