长白山有机灵芝提取物对小鼠细胞免疫力功能作用的研究

王欣宇，车成来，林花，王霞，王宇辉，玄东哲，金龙哲

(延边州农业科学院，吉林 延吉 133001)

长白山有机灵芝提取物对小鼠细胞免疫力功能作用的研究

王欣宇，车成来，林花，王霞，王宇辉，玄东哲，金龙哲*

(延边州农业科学院，吉林 延吉 133001)

研究长白山地区灵芝提取物对小鼠细胞免疫功能调节作用的影响。实验以4个剂量组经口灌胃，将小鼠随机分为高、中、低3进行灌胃，空白组以等量蒸馏水处理，给小鼠连续给药30d，对小鼠进行细胞免疫功能调节的测定。结果表明，长白山有机灵芝提取物具有提高免疫力功能的作用。

长白山地区；有机灵芝；免疫功能

1 实验材料与方法

1.1 实验材料与剂量选择

样品由延边州农业科学院农特产品加工研究所提供。昆明种雄性小鼠由吉林大学基础医学院动物实验中心提供，合格证号为SCXK-(吉)2013-0001。成人剂量以60kg体质量摄入1.2g/60kg·bw·d，相当于人体摄入剂量的1、10和30倍，即0.02、0.2、0.6g/kg·bw·d，各剂量组以蒸馏水稀释。以蒸馏水为空白对照组，每组12只，每只小鼠灌胃量为0.2mL/10g·bw·d，灌胃30d，并测定其各项免疫指标。

1.2 方法

1.2.1 脏器/体重比值测定。将小鼠处死后，取脾脏和胸腺后称重，分别计算其脾脏/体重比值以及胸腺/体重比值。

1.2.2 迟发型变态反应(足跖增厚法DTH)。生理盐水洗涤羊血洗涤3次，腹腔免疫用2%(V/V)SRBC进行腹腔注射，每只注射免疫0.2mL(相当于1×108个SRBC)，待免疫4d时测量小鼠左后足跖的厚度，在测量足跖部位处皮下注射20%SRBC，每只小鼠注射20μL，24h后继续测量其左后足跖的厚度，测量3次，取平均值。

1.2.3 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)。将取无菌Hank’s液的小平皿，将脾置于其中，磨碎后制成单个细胞悬液。放于Hank’s液洗涤2次，离心，将细胞置于完全培养液(1mL)使其悬浮，台酚兰染色，计算活细胞数，将其浓度调至为3×108个/mL。每个细胞悬液分为两个孔，每孔1mL加入24孔板中，一组作为对照组，一孔加75μL ConA液，放于37 ℃、5%CO2培养箱中培养3d。在培养68h时，将每孔轻轻吸去0.7mL的上清液，并加入吸去相同量的RPMI 1640培养液(不含小牛血清)，同时每孔加入50μL 5mg/mL的MTT，培养4h。当培养完毕，加入1mL酸性异丙醇，使紫色洁净溶解至完全溶解后，导入2mL比色杯中，测OD值。

1.2.4 小鼠碳廓清实验。小鼠进行尾静脉注射印度墨汁(1∶4倍稀释)，注射后立刻计时。当注射2、10min时，在内眦静脉丛中取血20μL，并置于2mL的0.1%Na2CO3溶液中。测OD值，以Na2CO3溶液作为空白组。

1.2.5 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。2000r/min离心压积鸡红细胞10min，小鼠腹腔注射20%悬液1mL，30min后将小鼠处死，取其体内巨噬细胞洗液1mL，滴至垫有湿纱布的载玻片上，放于盒内并移至孵箱37 ℃温育20min。孵毕，用生理盐水洗净未贴片细胞。待晾干后，甲醇固定，4%(V/V)Giemsa-磷酸缓冲液染色，生理盐水洗净，晾干备用。油镜下按照每片100个巨噬细胞计数，吞噬百分率或吞噬指数代表小鼠巨噬细胞的吞噬能力。

1.2.6 NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)。取靶细胞、效应细胞各100μL，分别加入96孔板中，向靶细胞释放孔分别加100μL的靶细胞和100μL的培养液，靶细胞最大释放孔分别加入100μL靶细胞、1%NP40，分别设有3个平行孔，于5%CO2培养箱中37℃ 培养4h，离心，每孔吸取100μL的上清液，待反应10min后，向每孔加入30μL 的1molHCl溶液，使其反应终止，测OD值，计算NK活性。

2 结果

表1 受试样品对小鼠脏器/体重比值的影响

表2 受试样品对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响

表3 受试样品对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力的影响

表4 受试样品对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清作用的影响

表5 受试样品对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响

按不同剂量连续给予小鼠受试样品长白山有机灵芝提取物30d，经统计分析，小鼠脏器/体重比值、淋巴细胞的增殖能力、碳廓清功能、吞噬率、吞噬指数在0.02、0.2、0.6g/kg组与空白组比较均无显著性差异(P>0.05)，足跖肿胀度在中、高剂量组均高于空白组，且相比较有显著性差异(P<0.05)(见表1，2，3，4，5，6)。

表6 受试样品对小鼠NK细胞活性的影响

3 讨论

现代研究表明，通过提高宿主免疫功能实验发现，灵芝具有抗肿瘤作用[1-2]、增强抗病毒效果、且提高氧化酶活性使体内自由基清除起到抗衰老作用、降血脂等[3]在医学中起到极其重要的作用。本文以长白山地区特有的冷凉气候条件下栽培的有机灵芝为原料，探究长白山有机灵芝提取物对小鼠细胞免疫功能的调节作用。长白山有机灵芝提取物给予小鼠30d后进行观察，对小鼠各脏器/体重比值无差异，说明药物对小鼠无影响，在迟发型变态反应实验中，小鼠的足跖肿胀度在0.2、0.6g/kg组呈阳性，有明显增强小鼠的迟发型变态反应，研究表明上述实验结果与给药剂量有关；在动物给药期间，各剂量组药物均明显高于空白组药物，说明其具有提高ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞、促进单核-巨噬细胞碳廓清的能力，显著提高NK细胞抗瘤活性，说明长白山有机灵芝提取物可刺激人单核巨噬细胞，直接或间接激活巨噬细胞、NK细胞等免疫细胞，抑制嗜中性粒细胞自发性凋亡，使细胞因子有序生长。实验表明，受试样品可增强特异性和非特异性细胞免疫功能，具有提高免疫力功效的作用。根据《保健食品功能学评价程序与检验方法规范》，长白山有机灵芝提取物具有增强免疫力功能的作用。

[1]邓海林,吴佩颖,王建新. 灵芝的研究进展[J]. 时珍国医国药,2005,16(2): 141-143.

[2]林志彬. 灵芝抗肿瘤活性和免疫调节作用的研究进展[J]. 北京大学学报: 医学版,2002,34(5): 493-498.

[3]You YH,Lin ZB. Protective effects of Ganoderma lucidum polysaccharides peptide on injury of macrophages induced by reactive oxygen species[J]. Acta Pharmacol Sinica,2002,23(9): 787-791.

2017-09-19

*通讯作者：金龙哲(1965-)，男，副研究员，研究方向：农特产品加工，E-mail:664130853@qq.com。

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.06.016

S567.3+1

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