家蚕抗菌肽基因BmMoricin的克隆及重组蛋白的自诱导表达

谢昆　丽仙　王靖　朱灵明　尹建华　叶青霞　孙艳

摘要：抗菌肽是构成昆虫体液免疫的主要方式，BmMoricin是家蚕免疫系统中1种重要的抗菌肽，具有极强的抑菌活性。以家蚕中肠组织总RNA为模板，设计1对特异性引物，通过RT-PCR技术扩增BmMoricin，构建pET32a-BmMoricin原核表达载体，采用自诱导表达系统表达BmMoricin重组蛋白。结果表明，BmMoricin基因片段的大小为201 bp，编码66个氨基酸，自诱导表达的BmMoricin重组蛋白大小约为19 ku，表达产率比异丙基-β-D-疏基半乳糖苷（IPTG）诱导的重组蛋白表达产率高，为BmMoricin抗菌肽的生物学活性鉴定及应用奠定了基础。

关键词：家蚕；抗菌肽；BmMoricin；重组蛋白；自诱导

中图分类号： Q785；S8812+4文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）21-0052-03[

收稿日期：2016-06-30

基金项目：云南省大学生创新创业训练计划（编号：DCXM163018）；红河学院大学生科技创新项目（编号：SZ1520）；红河学院应用型科学研究项目（编号：XJY15Z07）；红河学院博士专项（编号：XJ15B13）。

作者简介：谢昆（1975—），男，云南昆明人，博士，副教授，主要从事动物生物化学与分子生物学研究。E-mail：xk_biology2@126com。

在昆虫细胞中，天然免疫是主要的免疫屏障，抗菌肽在阻止微生物入侵和预防感染方面具有重要的作用，抗菌肽具有分子量低、热稳定性强、抗菌性广谱、抑菌活性强等优点[1]，绝大部分的抗菌肽由复杂的基因家族编码，因此大量的抗菌肽是宿主抵抗微生物感染的主要方式[2-3]。在细胞内抗菌肽的诱导表达受Toll和IMD信号途径的调控[4]，然而，抗菌肽的生物学功能也各有差异，抗菌肽Cecropins和Moricin具有极强的抗革兰氏阳性和革兰氏阴性菌活性，但抗真菌活性较弱，而Drosomycin具有极强的抗真菌活性，不同的抗菌肽家族成员之间抗菌机理也不同[5-6]。在家蚕细胞中，家蚕抗菌肽BmMoricin最先是从家蚕血淋巴中分离得到，主要对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有抑菌活性，BmMoricin包含61个氨基酸残基，前22个形成预测的分泌肽，成熟的BmMoricin含39个氨基酸，通过其氨基端α-螺旋插入到细菌质膜，增加细菌的渗透压来抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，在BmMoricin[CM（215]家族的12个基因成员中，含8个B亚家族（BmMoricin B1～B8）、3个A亚家族（BmMoricin LA1～LA3）、1个BmMoricin基因，它们在家蚕抵抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌方面具有极其重要的作用[7]。自诱导表达系统是Studier于2005年发现的，该系统中含有一定比例的葡萄糖和乳糖，葡萄糖耗尽后乳糖才被利用，目的蛋白开始表达[8]。自诱导表达的最终菌体密度大，蛋白产量高，而且没有毒性，适于重组蛋白的高效表达[9]。本研究以5龄7 d家蚕中肠组织为材料，设计特异性引物，通过反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术扩增BmMoricin基因，构建pET32a-BmMoricin原核表达载体，采用自诱导表达系统表达BmMoricin重组蛋白，以期为BmMoricin抗菌肽的抑菌活性研究和應用奠定基础。

1材料与方法

11试验材料

家蚕（青松×皓月），由云南省蒙自市家蚕养殖户提供。质粒小量提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒，均购自爱思进生物技术（杭州）有限公司；RNAiso Plus，购自宝生物工程（大连）有限公司；T4 DNA链接酶、限制性核酸内切酶，均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；DL2000 DNA marker、RT-PCR试剂盒、高分子量预染蛋白marker，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。LB培养基：称取100 g胰蛋白胨、50 g 酵母抽提物、100 g氯化钠，加入950 mL蒸馏水中，搅拌直至完全溶解，用10 molL的NaOH调节pH值为74，以蒸馏水定容至1 000 mL，105 kPa高压灭菌20 min；ZYM-5052培养基：精确称取7098 g Na2HPO4、6804 5 g KH2PO4、11090 5 g NH4Cl、0710 2 g Na2SO4、0240 72 g MgSO4、0222 g CaCl2、0198 g MnCl2、0288 g ZnSO4、0047 g NiCl2、0048 4 g NaMoO4、0012 g H3BO3、5 mL甘油、06 g葡萄糖、2 g 乳糖，加入950 mL蒸馏水中，搅拌直至完全溶解，以蒸馏水定容至1 000 mL，105 kPa高压灭菌20 min。

12试验方法

121引物设计

根据GenBank上公布的BmMoricin（AB0069151）mRNA序列，应用Primer Primer 50引物设计软件设计1对特异性引物为F：5′-CATG[ZZ（Z]CCATGG[ZZ）]CAAAAAT [JP2]ACCTATCAAGGCCATTAAGACTGTAGGAAAGGCAGTCGGTA-3′，R：5′-CCG[ZZ（Z]CTCGAG[ZZ）]TCAATGCTTTCTTTTCTTCGGTTTCA AGAAATTGAAAACATC-3′，下划线部分为限制性内切酶识别位点，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

122总RNA提取及RT-PCR扩增

取5龄7 d家蚕的中肠组织，应用RNAiso Plus提取其总RNA，提取方法参考《分子克隆实验指南》[10]。应用宝生物工程（大连）有限公司的PrimeScriptTM One Step RT-PCR试剂盒，RT-PCR扩增出BmMoricin抗菌肽基因，2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。endprint

123表達载体的连接、转化及鉴定

DNA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，用NcoⅠ、XhoⅠ双酶切BmMoricin基因和pET32a载体，构建pET32a-BmMoricin原核表达载体，质粒的连接、转化、酶切鉴定、PCR鉴定等操作方法均参考《分子克隆实验指南》[10]。

124重组蛋白的异丙基-β-D-巯基半乳糖苷（IPTG）诱导表达

构建的重组质粒转化BL21感受态细胞，加入终浓度为01 mmolL的IPTG诱导表达重组蛋白，分别收集诱导0～6 h的菌液，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测重组蛋白的表达情况。

125重组蛋白的自诱导表达

按照Studier的方法进行自诱导表达研究[8]。挑取含有重组质粒的单菌落，接种到4 mL含有100 μgmL氨苄青霉素（Amp）的LB培养基中，37 ℃ 、220 rmin培养过夜，再按1%的接种量接种到10 mL含有100 μgmL Amp的ZYM-5052培养基中，37 ℃、220 rmin培养12、14、16、18、20、22 h后收集菌液，与IPTG诱导的菌液进行SDS-PAGE检测分析，比较两者重组蛋白表达产率的差异。

2结果与分析

21家蚕抗菌肽基因的RT-PCR扩增

以5龄7 d时期家蚕的中肠组织总RNA为模板，通过 RT-PCR技术扩增家蚕抗菌肽基因BmMoricin。由图1可知，目的基因片段的大小约为201 bp，可以编码66个氨基酸，与预期结果一致。

[FK（W15][TPXK1tif]

22表达载体的构建

构建pET32a-BmMoricin原核表达载体，转化BL21感受态细胞，提取重组质粒，PCR和NcoⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定结果如图2、图3所示。从图2可以看出，经PCR鉴定重组质粒的大小与图1中RT-PCR的结果一致；从图3的重组质粒的双酶切鉴定结果可以看出，大片段为pET32a载体片段，小片段为酶切后的BmMoricin小片段。

23抗菌肽重组蛋白的自诱导表达

抗菌肽分别经1 mmolL IPTG诱导0、1、2、3、4、5、6 h和自诱导表达12、14、16、18、20、22 h后，由图4可知，IPTG和自诱导表达系统皆能成功表达BmMoricin重组蛋白（箭头所指），表达的重组蛋白大小为19 ku，自诱导系统组表达的重组蛋白产率明显高于IPTG诱导组。

3讨论

昆虫是一类进化上较为低等的动物，同时也是世界上种类和数量最多的动物。面对大量的外源微生物的侵害，虽然没有类似于哺乳动物的特异性免疫系统， 但是仍然能够较好地生存，说明昆虫必定有对非特异因子产生免疫应答的高效先天免疫系统，昆虫的免疫系统由体液免疫和细胞免疫组成[11]。昆虫的体液免疫与高等动物有明显的差异，主要依赖血液中的抗菌肽和蛋白质。当昆虫机体受到病原微生物侵染时，体内的识别蛋白能够识别微生物表面的肽聚糖或脂多糖及其他物质，引发丝氨酸蛋白酶和解除丝氨酸蛋白酶抑制剂的细胞外级联反应，激活细胞内信号转导途径，最终在其脂肪体、血液、中肠和表皮等器官或组织中诱导产生抗菌肽，进而杀灭外源微生物[12]。2006年Cheng等通过对家蚕基因组框架图序列的搜寻，找到了35条抗菌肽基因序列[2]。Moricin是由Hara等首先从家蚕血淋巴中分离得到的，对革兰阴性菌和革兰阳性菌均有强烈的抗菌活性，家蚕抗菌肽moricin（BmMoricin）由61个氨基酸残基组成，在其N-末端部分每隔3～4个氨基酸残基就有带电荷氨基酸，只形成1个长的具有亲水脂性质的α-螺旋结构，在C-末端则存在碱性氨基酸残基串，没有发现BmMoricin有氨基酸的修饰，其抗菌机制可能是利用碱性C端与细胞膜表面作用，然后利用N端改变膜的通透性，形成离子通道[13]。BmMoricin的等电点高达120，对细菌的抗性明显高于BmCecropin家族各成员[13]。

本研究通过RT-PCR技术从5龄7 d家蚕中肠组织中克隆BmMoricin抗菌肽基因，构建pET32a-BmMoricin重组表达载体，采用自诱导表达系统在大肠杆菌中对重组蛋白进行自诱导表达，SDS-PAGE检测结果表明，自诱导系统组的重组蛋白表达产率明显高于IPTG诱导组。试验结果为家蚕抗菌肽的纯化、活性鉴定奠定了基础。

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