鸡Ⅱ型抗菌肽LEAP-2的原核表达及抑菌研究

许冬梅，武晋孝，田文霞，闫 芳，高文伟，马海利，郑明学，程志学，赵宇军

鸡Ⅱ型抗菌肽LEAP-2的原核表达及抑菌研究

许冬梅1，武晋孝2，田文霞3，闫 芳3，高文伟3，马海利3，郑明学3，程志学3，赵宇军3

（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；2.山西省饲料兽药检查所，山西太原030027；3.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

为了研究鸡Ⅱ型抗菌肽LEAP-2的体外表达产物的活性，试验进行了肝脏样品无菌采集，基因的克隆及密码子优化和表达，以表达产物对致病菌做纸片法药敏试验，判断其抑菌作用。结果表明，试验经低温处理获得了较好的肝脏总RNA，克隆并优化了鸡LEAP-2基因；经诱导得到了表达产物，形式为包涵体；抑菌试验表明，表达产物对16株分离致病菌具有抑制作用。

鸡；LEAP-2；抗菌肽；原核表达；抑菌试验

鸡LEAP-2，是肝脏表达Ⅱ型抗菌肽，为肝脏中产生并微量存在的一种抗菌肽[1-8]。在肉鸡和蛋鸡养殖中，细菌感染和继发感染的治疗是一类比较棘手的问题。现代生活中，人们膳食结构的改变和对饮食质量的要求使得肉鸡和蛋鸡的生产逐年增加，其幅度之大可以用指数增长来形容。而动物的大量集中和高密度饲养使得病原菌有了很好的滋生条件，同时药物的残留及有效的抗生素在兽医领域的禁用，导致了养鸡生产中针对细菌感染的药物选择越来越少，鸡LEAP-2抗菌肽的发现为解决这种困境提供了一种新的思路[9-16]。

本研究针对从鸡肝脏中克隆并优化了密码子的LEAP-2进行了原核表达，旨在能够提供一种可供选择的抗菌产品来缓解生产中病原菌的困扰。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 5只2周龄健康红布罗鸡，购自太谷县肉鸡养殖场。4株致病性大肠杆菌来源于山西农业大学动物科技学院预防系兽医微生物实验室分离菌株。

1.1.2 主要试剂 DEPC溶液及DNA凝胶回收试剂盒、反转录试剂盒Code#AT301-02、质粒小提试剂盒、DNA限制性内切酶Eco RI和Not I、反转录试剂盒E.coli DH5α，均购自天根生化科技（北京）有限公司；ITrizol试剂（货号15596026），购自北京索莱宝科技有限公司；Trans5K DNAmarker，购自北京全式金生物技术有限公司；低分子蛋白Marker，购自上海酶联生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据NCBI基因库中相关的序列设计引物，上游、下游引物序列分别为：LEAP-2 F （sense）：5′-GAA TTC ATG CAC TGC CT-3′，LEAP-2 R （anti-sense）：5′-GCG GCC GCT CAC TCGGACG-3′，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.2 肉鸡肝脏总RNA的提取 口腔内剪断鸡眼两侧动脉，放血处死肉鸡，将整只鸡浸泡于70%的乙醇中5 min，取出，在超净台上打开腹腔，剪取肝脏，于DEPC处理过的平皿中剪成碎片，每份称取50～100 mg，保存于液氮中；另取一份放于-20℃冰箱内提前降温的研钵内进行研磨，磨到溶液变得透明；将液体转移到1.5 mL的EP管中，取200μL氯仿加入，振荡30 s后静置10 min[5-7]，RNA的提取处理参照《分子克隆手册》（2004-1）进行。

1.2.3 LEAP-2基因扩增 基因扩增的体系：上游引物 1 pmol，2×TSReaction Mix 10 μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，RNA 5 μL，RNase Free ddH2O至20μL。PCR反应条件为：42℃30 min，85℃5 s，放置在-20℃备用。LEAP-2基因PCR扩增的反应体系：10×PCR Buffer 2μL，dNTPMixture 1.6μL，上下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，cDNA 1μL，ddH2O 13.2μL。PCR条件：94℃预变性3 min；95 ℃变性 1 min，52 ℃ 30 s，72 ℃延伸 1 min，30个循环；扩增产物连接到T载体送交上海生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.4 LEAP-2原核表达 鉴于鸡LEAP-2基因为260 bp左右，交上海生物工程技术服务有限公司合成，使用载体为PGEX-6P-1，合成之前进行密码子优化，LEAP-2基因与载体链接使用HindⅢ与BamhⅠ定向连接，命名为PGEX-6P-LEAP-2，IPTG 0.8 moL/L，37℃2 h，诱导菌离心后经超声波裂解，再经变性复性之后经GST标签柱层析进行鉴定[3，6-7，15]。

1.2.5 纸片法检测表达产物的抑菌作用 制备直径为3mm的定量滤纸纸片，浸入质量浓度为0.1mg/L的表达产物纯化液中，30 s后取出备用；将山西农业大学动物科技学院预防系兽医微生物实验室分离的鸡4株致病性大肠杆菌接种至营养肉汤，37℃培养8 h，将肉汤以三角玻璃棒均匀涂布于营养琼脂表面，共4个平皿，将纸片轻轻贴附于琼脂表面，37℃培养过夜观察结果，测量抑菌环直径，并记录。

2 结果与分析

2.1 肉鸡肝脏mRNA提取

肝脏经低温处理研磨后进行电泳，结果显示，肝脏总RNA提取效果良好。

2.2 LEAP-2基因扩增结果

经PCR扩增后获得了目标基因，大小为263 bp，经测序并于NCBI基因库中进行BLAST同源性序列检索，确定为LEAP-2基因（图1）。

2.3 LEAP-2表达

密码子优化后的合成基因经诱导及经过层析柱纯化，主要存在于沉淀中，大小为33 ku（图2）。

2.4 纸片法抑菌

经37℃培养后，对4个平皿进行抑菌圈直径测量，表达蛋白的复性产物对4株山西农业大学动物科技学院预防系兽医微生物实验室保存菌株的抑菌圈均在6 mm左右，结果表明，该表达产物具有一定的抑菌作用，其结果列于表1。

表1 表达产物对4株致病性大肠杆菌的抑制作用 mm

3 讨论

鸡LEAP-2是一类体内表达量很小的多肽，在实际应用中直接从动物体提取，成本较高，较难在实际生产中得到应用，利用生物技术进行制备是一种新的选择[17-18]。

肝脏总RNA的提取相对来说比较困难，因为在肝脏内有较其他组织中多的RNA酶，在提取过程中注意对低温和操作的严谨性有较高的要求。笔者在综合了其他组织RNA提取的文献资料后，经过对几种不同方法的比较，得到了比较有效的肝脏总RNA。

很多组织可以产生抗菌肽，肝脏表达的抗菌肽具有一定的使用前景[19-20]，从产生部位来看，可以直接对经由消化道进入血液系统的微生物进行第一时间处理，但其表达量的限制，使得直接提取成本较高，本研究的表达虽然尝试了体外表达的生物学技术，然而表达的效果依然不能有效降低生产成本。因此，对该抗菌肽的生产应用技术措施仍有待继续探索。

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Study on Prokaryotic Expression and Bacteriostasis Activity of Chicken Type II Antimicrobial Peptide LEAP-2

XUDongmei1，WUJinxiao2，TIANWenxia3，YANFang3，GAOWenwei3，MA Haili3，ZHENGMingxue3，CHENGZhixue3，ZHAOYujun3
（1.Collegeof Life Science，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Feed and Veterinary Drug Inspection Department of Shanxi Province，Taiyuan 030027，China；3.Collegeof Animal Science and Veterinary，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Todeterminetheantibiotic activity of chicken LEAP-2 expressed in vitro,the geneof LEAP-2 was applied by RT-PCR instructed by the sequence NM_001001606,and then wasdone with codon optimization and cloned into pGEX-6P-1.After expressed in E.coli DE3,the expressed product was managed to do antibiotic experiment by bacteriostasis circle test.Theresults showed that chicken LEAP-2 gene had a satisfied gain under liquid nitrogen processing,LEAP-2 was cloned and after optimized then expressed by incusion bodiestype,antimicrobial susceptibility test result showed that 16 E.coli strain owned in laboratory was sensitived tothe protein.

chicken;LEAP-2;antimicrobial peptide;prokaryotic expression;bacteriostatic test

S831.5

A

1002-2481（2017）12-1998-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.12.24

2017-08-29

山西省科技攻关项目（20140311021-3）

许冬梅（1974-），女，山西太谷人，讲师，硕士，主要从事动物遗传及机制研究工作。赵宇军为通信作者。