FGF8、SHH、FOXL2基因在鸡胚成纤维细胞中的调控作用研究

张虎军,赵宗胜*,翟曼君,郑炜,李青峰

（1石河子大学生命科学学院，新疆 石河子 832003；2石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003）

FGF8、SHH、FOXL2基因在鸡胚成纤维细胞中的调控作用研究

张虎军1,赵宗胜2*,翟曼君2,郑炜2,李青峰2

（1石河子大学生命科学学院，新疆 石河子 832003；2石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003）

为了研究SHH、FGF8和FOXL2三个基因在鸡和鹌鹑杂交禽胚胎早期发育中的作用，分别构建鸡SHH、FGF8和FOXL2三个基因共9个RNA干扰载体，构建FGF8基因和SHH基因的过表达载体；将干扰载体和过表达载体分别转染鸡胚成纤维细胞。结果表明：FGF8基因通过MAPK信号通路影响杂交种胚胎早期发育；SHH基因通过Hedgehog信号通路影响杂交种胚胎早期发育；FOXL2基因通过调节DMRT1、SOX9和CYP19等基因的表达变化来影响杂交种胚胎早期发育。本研究可为进一步研究雌性杂交种胚胎早期死亡的原因奠定理论基础。

鸡与鹌鹑杂交；RNA干扰；FGF8基因；SHH基因；FOXL2基因

鸡(♂)与鹌鹑(♀)属间杂交属于典型的远缘杂交，由于存在杂交不亲和现象，鸡与鹌鹑杂交禽孵化率较低且后代不育[1-2]，主要表现在早期胚胎发育异常甚至大量死亡[3]。本课题组前期研究证实，鸡与鹌鹑属间杂交种胚胎早期死亡与雌激素受体ER、3-βHSD和P-450c17等相关基因的异常表达有关[4-6]。

基于前期构建的鸡与鹌鹑属间杂交种早期不同性别胚胎小RNA文库[7]，结合杂交后代孵化第3天的雌雄胚胎6个数字表达谱（DGE）文库分析技术[8]，筛选到了部分在杂交种中差异表达的基因（ROR2、CCND1、SHH、FGF8和 FOXL2等）。

FGF8（Fibroblast growth factor 8）是成纤维细胞生长因子家族成员之一，是发育中重要的分泌性调控信号分子，在胚胎发育时期的多种组织中均有所表达，参与脊椎动物胚胎时期多种组织器官的发生、分化和发育[9]。FOXL2（Forkhead box L2）是迄今为止研究所发现的脊椎动物卵巢发生和分化的最早标志性启动基因，在胚体性别决定前的生殖脊上开始表达，影响胚胎的性分化，促使胚胎性别雌性化[10]；在鸡雌性胚胎性腺髓质中有 FOXL2基因的表达，参与调节芳香化酶的转录表达[11]。Crisponi等[12]认为FOXL2基因通过与TGFβ家族的信号通路相互作用来影响卵巢的发育。有研究[13-14]表明，FOXL2基因参与性别决定是通过芳香化酶和 SOX9基因这2条途径来发挥作用的。

1980年，Nüsslein Volhard等[15]在通过筛选果蝇突变基因时发现Hedgehog基因。果蝇和其他无脊椎动物体内中只有1种Hh基因，在脊椎动物中Hedgehog家族有 Dhh（Desert Hedgehog）、Ihh（Indian Hedgehog）、Shh（Sonic Hedgehog）3 个亚型[16]。目前，研究最深入的、在体内表达最广泛的为Shh型，其参与大量器官和组织的发育生长[17]。Hedgehog信号通路在调控脊椎和无脊椎动物的胚胎发育中都发挥重要作用，参与调控细胞增殖、分化、组织的模式形成，是参与动物发育的关键调控因子之一[18-20]。

本研究拟在鸡胚细胞中调控差异基因的表达量，分析相关基因变化，了解相关基因差异表达对鸡胚细胞、胚胎发育的影响，并以此为模型为深入研究鸡（♂）×鹌鹑（♀）杂交后代早期胚胎发育异常甚至死亡奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

种鸡蛋80枚（购买自石河子种蛋孵化场），在实验室用孵化机自行孵化。除了外在因素外，杂交种早期胚胎大批死亡的确切的时间应为(72±6)h，所以实验采用孵化3 d的鸡活胚胎用于后续实验，样品采集后迅速置于液氮中保存。

1.2 方法

1.2.1 鸡胚细胞的分离、培养与鉴定

购回种蛋孵化至第10天，无菌条件下，取出胚胎，剪去头、四肢，并除尽内脏，骨骼，只留躯干部肌肉，剪碎肌肉组织，0.25%胰蛋白酶37℃水浴消化10 min，每3 min振荡1次，加入等量10%胎牛血清F12培养液终止消化，1000 r/min离心10 min，弃上清液；加入完全培养液轻柔吹散离心管底部细胞团，细胞筛过滤后，将细胞悬液均匀铺于培养皿中，置于37℃、5%CO2条件下的培养箱中培养，6 h后换液。

细胞传代：当原代细胞约90%铺满培养瓶底，即可进行传代。0.25%胰蛋白酶消化1 min，含1%双抗的PBS温和清洗细胞2-3次，加入完全培养基终止消化，1000 r/min离心5 min，加入10%胎牛血清F12培养液轻柔悬浮细胞，将细胞悬液接种到培养瓶中，置于37℃、5%CO2条件下的培养箱中培养。

鸡胚成纤维细胞的鉴定：取传至第2代长势良好细胞，制成细胞悬液，将细胞悬液接种在放置于6孔板中的经过清洗、泡酸、高压灭菌等处理后的盖玻片上，放置于CO2细胞培养箱中培养，待细胞长满（约12 h）时取出细胞爬片。免疫组化过程参照SP试剂盒说明书进行；用苏木精染液复染1-2 min，流水温和冲洗，进行常规脱水、透明、中性树胶封片，观察。根据上述实验结果确定细胞类型，选择纤维状形态正确，无杂细胞污染的细胞用于后续实验。

1.2.2 F GF8、SHH基因表达载体构建

根据NCBI公布FGF8（登录号：NM_001012767.1；U41467.1）、SHH（登录号：NM_204821.1）基因序列，利用Primer 5.0设计基因全长特异性引物，需包含目标基因完整编码区，分别加入相应酶切位点（EcoR I、Xho I、HindIII、KpnI） 和相应的保护碱基，引物具体参数见表1，引物由北京华大生物技术有限公司进行合成。

表1 FGF8和SHH基因引物序列Tab.1 Primers of FGF8 gene and SHH gene

目的基因扩增PCR反应体系为：2×Es Taq PCR Master Mix，12.5 μL；上、下游引物各 1 μL；cDNA 1 μL；ddH2O，6.25 μL，共 25 μL。PCR 扩增反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，61 ℃（FGF8）、68 ℃（SHH） 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 10 min，4℃保存。将获得的 PCR扩增产物全部用于琼脂糖凝胶电泳，电泳后，胶回收目的片段，将FGF8、SHH基因PCR胶回收纯化产物分别与pEGFP-C2表达载体进行连接。连接体系为：酶切后回收的pEGFP-C2，2 μL；PCR 胶回收产物，5 μL；T4 DNA ligase(400 U/μL），1 μL；10×T4 DNA Ligase Buffer，2 μL；链接反应条件：4℃ 16 h。连接产物转化DH5α感受态细胞，涂板，挑菌，37℃摇菌后，菌液PCR筛选阳性克隆，保菌，进行酶切鉴定，送北京华大公司测序，验证目的基因片段是否正确。

1.2.3 F GF8、SHH和FOXL2基因RNAi载体构建

根据靶基因 FGF8（GenBank:NM_001012767.1）、SHH （GenBank:NM_204821.1）、FOXL2（GenBank:JF708868.1）的 mRNA序列，按照 RNAi片段设计原则，GeneLink（http://www.genelink.com/sirna/RNAicustom order.asp）等专业设计网站，每个基因分别设计并合成3对 RNA干扰片段，然后使用Oligo 6和Primer premier 5分别评估shRNA的结构是否正确和双链是否配对。

干扰载体骨架酶切体系：10×K Buffer，2 μL；miRZip 载体，2 μg；BamHI，1 μL；EcoRI，1 μL；ddH2O，14 μL，共 20 μL。37 ℃酶切 3 h后电泳，胶回收线性载体。shRNA双链的合成：TE缓冲液稀释shRNA模板单链，进行退火反应。反应体系：shRNA-F，5 μL；shRNA-R，5 μL，共 10 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min，85 ℃ 5 min，75 ℃ 5 min，70℃ 5 min。合链后的 shRNA模板保存于-20℃，后续与干扰载体骨架进行连接。

干扰载体骨架pmiRZIP与shRNA片段连接：pmiRZIP载体回收片段，3 μL；退火干扰片段稀释液，3 μL；10 ×T4 DNA ligase buffer，2 μL； T4 DNA ligase，1 μL，加 dd H2O 补至 20 μL。反应条件：PCR仪16℃过夜连接16 h。连接产物转化DH5α感受态细胞，涂板，挑菌，37℃摇菌，甘油保菌送北京华大公司测序，以确定序列和位置完全正确。

将构建完成测序正确的重组质粒菌液进行扩大培养，扩大培养后进行质粒大提，提取完成后使用核酸浓度检测仪进行浓度测定并记录，-20℃保存备用。

1.2.4 细胞转染

（1）选取生长状态良好的鸡胚成纤维细胞，接种入6孔板中置于37℃ 5%CO2培养箱中培养，次日待用。（2）传代细胞长至85% 以上即可进行转染，转染前4 h将培养液换为无双抗、无血清的DMEM培养液。脂质体 Lipofectamine 2000浓度为1 μg/μL，质粒具体加入量根据提取质粒浓度计算。实验采用脂质体Lipofectamine 2000转染细胞，脂质体（μL）:质粒（μg）比例为 1∶1.5。（4）将 6孔板中1 mL培养液吸弃500 μL，逐滴加入孵育完成的转染液，与培养液充分混匀，放入细胞培养箱中培养；6 h后换为完全培养液。（5）培养24 h后可在荧光倒置显微镜下观察荧光，若荧光较少，可继续培养。（6）通过观察荧光、细胞形态、死细胞数量确定质粒与脂质体最佳比例。（7）转染36 h后收集细胞做后续实验。

1.2.5 分析 FGF8、SHH和 FOXL2基因对参与信号通路的影响

干扰、过表达载体转染鸡胚细胞及细胞RNA的提取和反转录方法同前，通过实时荧光定量(MX3000P)PCR方法检测 FGF8基因及该基因参与的MAPK信号通路中相关下游基因 mRNA表达量。根据NCBI上公布的FGF8序列，利用 Primer 5.0设计引物，内参基因为GAPDH。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）反应体系：SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 9.5 μL，共 20 μL。反应条件：94 ℃ 10 min；94℃ 30 s，目标基因退火温度 20 s，72℃20 s，45个循环；95℃ 1 min，目标基因退火温度30 s，95℃ 30 s，所有实验组进行3个重复。同法检测 SHH基因及该基因参与的 Hedgehog信号通路中相关下游基因 mRNA 表达量，同法检测FOXL2基因及参与性分化DMRT1、Sox9、CYP19等基因 mRNA表达量，相关基因引物和内参基因GAPDH 引物参数见表2。

表2 荧光实时定量PCR引物序列Tab.2 Real-time fluorescent quantitative PCR primers

续表2

2 结果与分析

2.1 表达、干扰质粒作用效果检测

本研究构建了FGF8基因和SHH基因的2个过表达载体，FGF8基因、SHH基因和FOXL2基因干扰载体各3个；用qRT-PCR检测表达、干扰基因的表达量，以 GAPDH为内参，通过 2-△△Ct计算相对表达量，SPSS 19.0进行显著性差异分析。将过表达重组质粒、干扰质粒转染鸡胚细胞，转染方法同前，具体实验分组如下：FGF8基因：过表达载体分3组：空白对照组，空载体组和pEGFP-FGF8组；干扰载体分5组：空白对照组，空载体组，shFGF8-1组，shFGF8-2组和shFGF8-3组；SHH基因和FOXL2分组同上，每个实验每组重复3次。

表3 各基因相对表达量Tab.3 Expression level of mRNA of genes in chicken embryo cell

由表3可见，FGF8基因过表达载体实验组的FGF8基因mRNA表达水平显著高于空白对照组和空载体组，差异极显著（P＜0.01），表达量上升62.8倍，这表明FGF8基因在细胞内高效表达，pEGFP-FGF8过表达质粒构建成功。FGF8干扰载体实验组 shFGF8-1组、shFGF8-2组和 shFGF8-3组中目标基因的mRNA表达量均低于空白对照组和空载体组；shFGF8-1组、shFGF8-2组和shFGF8-3组目标基因表达量分别降低了39.8%、53.5%和25.3%；shFGF8-2组干扰效率最高，后续实验使用shFGF8-2进行干扰实验。SHH过表达载体实验组的SHH基因mRNA表达水平显著高于空白对照组和空载体组，差异极显著（P＜0.01），表达量上升92.3倍，表明pEGFP-SHH表达质粒构建成功。shSHH-1组、shSHH-2组和shSHH-3组目标基因表达量分别降低了 46%、40%和 58%，shSHH-3组干扰效率最高，后续实验使用shSHH-3进行干扰实验。FOXL2干扰载体实验组 shFOXL2-1组、shFOXL2-2组和shFOXL2-3组中目标基因的mRNA表达量均低于空白对照组和空载体组；shFOXL2-1组、shFOXL2-2组和shFOXL2-3组目标基因表达量分别降低了24.2%、38.5%和68.6%，shFOXL2-3干扰效率最高。

2.2 FGF8、SHH、FOXL2 基因对胚胎发育的影响

2.2.1 实时荧光定量分析FGF8对MAPK信号通路的影响

通过FGF8基因干扰和过表达载体对鸡胚成纤维细胞处理，对MAPK信号通路下游基因FGFR、GRB2、MEK1、MEK2、MPKA1、Raf1、SOS1、KRAS、MRAS的mRNA表达量的检测结果（表4）显示：当FGF8基因表达受到抑制时，FGFR基因的表达量升高，而当FGF8基因过表达时，FGFR的表达量同样升高，但差异均不显著。当FGF8基因过表达时，GRB2、KRAS、MRAS表达量降低，MRAS差异显著，而 MEK1、MPKA、Raf1、SOS1表达量升高，其中 MPKA1和 SOS1差异显著；当FGF8基因表达受到干扰时，GRB2、MEK1、MEK2、RAF1、KRAS 表达量降低，其中 GRB2、MEK1差异显著，而MPKA1、SOS1和MRAS的表达量显著升高。

表4 各基因相对表达量Tab.4 Expression level of mRNA of genes in chicken embryo cell

2.2.2 实时荧光定量分析细胞凋亡基因的影响

对凋亡基因 p53、Bcl-2的实验结果表明：FGF8基因干扰时，p53基因表达量显著上升，而干扰后Bcl-2表达水平显著下降，FGF8基因过表达处理后对p53和Bcl-2基因表达影响不显著，p53表现为略微上调而Bcl-2表现为略微下调，差异均不显著。

2.2.3 实时荧光定量分析SHH对Hedgehog信号通路通路的影响

通过SHH基因干扰载体和过表达载体对鸡胚细胞处理后，对于Hedgehog信号通路下游基因PtcH1、Smo、Gli1、Gli2、Gli3、Wnt，结果见表 4。当 SHH基因表达受到抑制时，PtcH1的表达量显著降低，而当SHH基因过表达时，PtcH1的表达量显著升高。当SHH基因表达受到干扰时，Ptch1、Gli1、Gli2表达水平显著下降，Gli1差异极显著，而Smo、Gli3、Wnt表达量表现为显著升高，其中Smo、Wnt差异极显著；当 SHH 基因过表达时，Smo、Gli3表达水平降低，其中 Smo差异极显著，而 PtcH1、Gli1、Gli2、Wnt表现为表达量显著升高，Gli1、Gli2、Wnt差异极显著。

2.2.4 实时荧光定量分析SHH基因对凋亡基因的影响

在凋亡基因p53、Bcl-2上的实验结果表明，过表达SHH基因后p53和bcl2基因的表达水平略有变化，但差异不显著。

2.2.5 实时荧光定量分析FOXL2对SOX9等基因和细胞凋亡基因的影响

FOXL2 基因干扰处理后，对 SOX9、DMRT1、CYP19和细胞凋亡相关基因p53、Bcl-2的mRNA表达量检测结果（表5）显示：当 FOXL2基因表达受到抑制时，SOX9和 DMRT1基因表达量显著上调，DMRT1基因差异极显著；CYP19基因表达量显著下降。对凋亡基因 p53、Bcl-2的实验结果表明：当干扰FOXL2基因使其表达水平下调时，p53和bcl2基因表达水平稍有变化，但差异不显著。

表5 各基因相对表达量Tab.5 Expression level of mRNA of genes in chicken embryo cell

3 讨论

在正常的生物体生长发育过程中均伴有细胞凋亡，主动的细胞程序性死亡涉及一系列相关基因的激活、表达以及调控等作用，但是在胚胎发育过程中细胞程序化死亡的放大或损伤性的细胞凋亡可能会引起胚胎畸形与发育异常。已有研究表明bcl-2、p53为调控细胞凋亡的关键因子，在凋亡转导途径中发挥着关键作用，bcl-2抑制细胞凋亡，p53则促进细胞凋亡。

FGF8在胚胎发育早期就开始表达，FGF8能够与存在于细胞表面的 FGF受体（FGFR）特异性结合，然后将信号传递到细胞内，FGFR为络氨酸激酶受体，生长因子与受体结合进而激活络氨酸激酶，参与MAPK 信号通路[18]。本研究结果表明，当FGF8基因过表达和干扰时，FGFR表达量均出现升高；继续 检 测 下 游 基 因 Grb2、SOS1、KRAS、MRAS、RAF1、MEK1、MEK2，当FGF8基因过表达和干扰时，Grb2表达量降低，Grb2与生长因子受体络氨酸激酶激活 Ras（KRAS、MRAS）进而激活下游激酶 ERK1、ERK2，而使Grb2-Ras-MAPK信号通路激活而使胚胎细胞发育产生原始内胚层和外胚层[19]，并且激活后的 ERKs能够通过磷酸化作用调控下游基因的表达进而参与细胞增殖、分化、凋亡和各个组织的生长发育，FGF8基因的表达变化引起链接蛋白Grb2表达减少，进而影响后续一系列信号传递与通路的激活，对胚胎的生长发育产生影响。对凋亡基因p53和 bcl-2的分析结果显示，干扰FGF8基因时，p53表达量显著上升而bcl-2表达量显著降低，表明FGF8基因表达量降低促进细胞凋亡。

鸡和鹌鹑杂交种胚胎SHH基因出现异常表达，SHH基因是Hedgehog信号通路中关键基因之一，Hedgehog基因在进化上高度保守，SHH为分泌型配体蛋白，属于一类形态发生素，能够诱导细胞分化[15]。当SHH基因过表达，Hedgehog信号通路被激活；在SHH双等位基因突变的小鼠中，增加SHH基因活性会导致胚胎发育畸形[21]，推断杂交禽SHH基因的异常表达引起Hedgehog信号通路异常抑制或激活，进而影响杂交禽早起胚胎发育。Wnt基因是Hedgehog信号通路下游基因，抑制SHH基因的表达或增加SHH的表达，均可使Wnt的表达水平显著升高，有研究[15]指出在正常的鸡胚背侧体节的发育过程SHH对Wnt的表达具有抑制作用，表明早期胚胎发育中Wnt基因还受其它机制调节。对凋亡基因 p53和bcl-2的分析结果显示，干扰SHH基因时，p53和bcl-2基因的表达水平显著升高，而过表达SHH基因时，p53和bcl-2的表达量无显著变化，推测SHH基因的异常表达引起p53和bcl-2的异常表达，引起细胞凋亡的异常，从而影响胚胎早起发育。

FOXL2基因在胚胎性别分化时期具有引导性别分化方向的关键作用，参与脊椎动物早期性腺分化和发育，是目前发现最早的标志性卵巢分化启动基因，能够促进胚胎雌性化[22]，在胚胎期FOXL2基因的缺失会导致性别决定基因（SOX9、DMRT1等）表达紊乱而影响胚胎早期发育。鸟类Z染色体上的DMRT1基因，是目前所公认的雄性性别决定最佳候选基因，在鸡中DMRT1基因是在性分化时产生睾丸必不可少的，敲除雄性DMRT1基因后会导致小鸡雌性化，并且伴有FOXL2基因的表达上调[23]。本研究结果表明，当FOXL2基因表达受到干扰，SOX9基因的表达水平较正常组明显降低且差异显著，而DMRT1基因的表达水平显著升高，因此推测FOXL2基因与DMRT1基因存在一定的此消彼长关系。FOXL2基因表达被抑制后，CYP19A1基因的表达水平降低且差异显著，这一结果与已经得到证实的FOXL2基因能够调节CYP19基因的转录这一结论相一致。同时发现，FOXL2基因表达量降低后对细胞凋亡基因p53和bcl-2无显著影响。

综上所述，当 FGF8基因表达量发生变化时，在FGF8基因参与的MAPK信号通路中，使细胞间的链接蛋白Grb2表达量降低，不能正常激活MAPK信号通路，使其在胚胎发育过程中不能行使正常的生理功能，造成胚胎不能正常生长发育；在Hedgehog信号通路中，当SHH基因的表达受到抑制时 Hedgehog信号通路不能被激活而处于抑制状态，使胚胎早期发育异常；当SHH基因过表达时，能够成功激活Hedgehog信号通路，并且使该信号通路过度活跃，对胚胎发育产生不良影响；干扰FOXL2基因使其表达量水平降低，使胚胎发育早期参与性别分化的DMRT1、SOX9、CYP19基因表达出现紊乱，造成胚胎发育性分化过程不能正常进行，影响胚胎的正常生长发育。

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The regulation of FGF8,SHH and FOXL2 in chicken embryonic fibroblast cells

Zhang Hujun1,Zhao Zongsheng2*,Zhai Manjun2,Zheng Wei2,Li Qingfeng2
（1 College of Life Sciences,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China;2 College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China）

To research the function mechanism of SHH,FGF8 and FOXL2 in embryologic development of chicken-quail hybrids.Nine RNA interference vectors of FGF8,SHH,FOXL2 genes,two overexpression vectors of FGF8,SHH genes were constructed successfully,respectively.These vectors were transferred into chicken embryonic fibroblast cells by liposomes transfection,respectively.The results showed that FGF8 maybe influence early embryologic development of hybrid by effecting MAPK signaling pathway;SHH maybe affect embryologic development through having effect on Hedgehog signaling pathway;FOXL2 influence early embryologic development by regulating the expression level of DMRT1,SOX9 and CYP19.The results would build the theory base for further study of death reason during early development of female hybrid embryos.

chicken-quail hybrid;RNAi;FGF8;SHH;FOXL2

S831

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.05.017

1007-7383(2017)05-0625-07

2016-12-22

国家自然科学基金项目（30660125）

张虎军（1991-），男，硕士研究生，专业方向为动物遗传学与基因组学，e-mail：iamzhanghujun@163.com。

*通信作者：赵宗胜（1969-），男，教授，从事动物遗传育种与繁殖研究，e-mail：zhaozongsh@shzu.edu.cn。