平喘颗粒对哮喘大鼠气道重塑后表皮生长因子蛋白表达的影响

蒋鹏娜，刘建秋，李竹英,,3*，王雪慧

（1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040；2. 黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨 150040；3.黑龙江中医药大学北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，哈尔滨 150040）

平喘颗粒对哮喘大鼠气道重塑后表皮生长因子蛋白表达的影响

蒋鹏娜1，刘建秋2，李竹英1,2,3*，王雪慧2

（1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040；2. 黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨 150040；3.黑龙江中医药大学北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，哈尔滨 150040）

目的 通过测定哮喘大鼠气道重塑后表皮生长因子蛋白的表达，探讨平喘颗粒对哮喘大鼠气道重塑的作用机理。方法 将90只Wistar大鼠分为6组 , 每组15只，A、B组予以生理盐水灌胃，C组予0.5 mg布地奈德雾化吸入（2 次/d），D、E、F组给予中药低4.01 g/（kg·d）、中8.01 g/（kg·d）、高16.02 g/（kg·d）剂量灌胃。各组均于末次激发24 h后处死，取大鼠左肺中下段，切成1 mm3左右，并将其用2.5%戊二醛固定，以备电镜用。大鼠右肺切取后，先用PBS漂洗，吸干后置于液氮罐中速冻，之后保存于－80 ℃冰箱，用于RT-PCR检测。结果 平喘颗粒（低、中、高）组、布地奈德组和模型组的EGF mRNA蛋白表达均高于空白组，差异有统计学意义（p＜0. 05）。平喘颗粒（低、中、高）组和布地奈德组EGF mRNA蛋白的表达较模型组明显受到抑制，差异有统计学意义（p＜0.05）。平喘颗粒（中、高）组EGF mRNA蛋白的表达较布地奈德组降低,差异有统计学意义（p＜0.05）。平喘颗粒低剂量组EGF mRNA蛋白的表达较布地奈德组降低，但差异无统计学意义。结论 平喘颗粒可以改善和控制气道重塑过程中气道高反应和气道阻塞的状态，并且可抑制EGF mRNA的表达，从而保护肺部组织细胞，减轻哮喘发作。

平喘颗粒；气道重塑；表皮生长因子

支气管哮喘是临床常见的呼吸系统慢性气道疾病，是我国的常见病、多发病。哮喘是属于慢性气道高反应性疾病，研究[1]证实，主要与肥大细胞、嗜酸性粒细胞和 T 淋巴细胞有关。从病理角度来看，长期的慢性气道病变会进一步加重和刺激气道结构，造成气道重塑。气道重塑是在多种可溶性生长因子和炎性因子等因素参与作用下引起的慢性炎症对气道反复刺激的结果。表皮生长因子（EGF）是重要的生长因子，它可以促进结缔组织合成，造成气道重塑，还能加快上皮细胞和成纤维细胞的有丝分裂，进一步促进合成结缔组织[2]。本研究旨在探讨哮喘大鼠气道重塑后EGF蛋白的表达及平喘颗粒在治疗过程中的作用靶点及作用机制。

1 材料

1.1 动物 90只Wistar大鼠（健康SPF级），雌雄各半，平均体质量（200±20）g。由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供，合格证书号：SYXK（黑）2015010。随机分为6组。正常对照组（A）、模型组（B）、布地奈德组（C）、中药低剂量组（D）、中药中剂量组（E）、中药高剂量组（F），每组15只。

1.2 主要试剂 卵蛋白（OVA），Grade V，美国Sigma公司A5503。氢氧化铝干粉，天津市致远化学试剂有限公司，分析纯。氨基甲酸乙脂（乌拉坦）、戊二醛等电镜所需试剂，均由黑龙江中医药大学附属第一医院病理科提供。

1.3 实验药物 中药：淫羊藿15 g，黄芪10 g，太子参10 g，蜜麻黄10 g，款冬花12 g，五味子10 g，知母10 g，地龙10 g，罂粟壳4 g。加12倍量水浸泡1 h，煎煮1 h，滤过，再加10倍量水煎煮1 h，滤过，滤液合并，浓缩至相对密度为1.15～1.20（60 ℃）的浸膏即得，制备成每1 kg含81 g生药颗粒，用温开水进行稀释灌胃，根据人（70 kg）与大鼠(200 g)给药剂量比值1:0.018换算后，给予大鼠药液1 mL/100 g灌胃。布地奈德混悬液（普米克令舒），2 mL:1 mg，Astra Zeneca Pty Ltd。

2 方法

2.1 复制哮喘大鼠模型[3]所有Wistar大鼠先进行1周适应性喂养，之后开始建立哮喘模型，提前将1 mg卵蛋白与100 mg Al(OH)3（氢氧化铝）凝胶进行预混制成1% OVA无菌抗原液，在实验的第0、12天予大鼠腹腔注射，前5 d，每天用5% OV A进行雾化激发30 min，之后隔1 d 1次，共激发8周，复制哮喘模型。A、B组予以生理盐水灌胃，C组予0.5 mg布地奈德雾化吸入（2 次/d），D、E、F组给予中药低4.01 g/（kg·d）、中8.01 g/（kg·d）、高16.02 g/（kg·d）剂量灌胃治疗[4]。2.2 取材与样品处理 1）各组均于末次激发24 h后，用20%乌拉坦，按5 mg/kg腹腔注射麻醉，取大鼠左肺中下段，切成1 mm3左右，并将其用2.5%戊二醛固定，以备电镜用。2）将上述各组实验大鼠右肺切取后，先用PBS漂洗，吸干后置于液氮罐中速冻，之后保存于-80 ℃冰箱，用于RT-PCR检测。

2.3 实验步骤

2.3.1 电镜观察肺组织超微结构 肺组织在4 ℃，2.5%戊二醛中固定2 h，用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗3次，15 min/次；再用1%锇酸固定组织块，4 ℃，3 h，后用蒸馏水漂洗3次，10 min/次；之后进行脱水，脱水后进行包埋；用100%丙酮+2:1包埋液给组织常温渗透3 h，再用100%丙酮+1:2包埋液给予常温过夜，在37 ℃下用100%包埋液渗透2 h；然后依次于37 ℃、45 ℃、60 ℃在烘箱内固化；最后切成60 nm厚的切片。

2.3.2 RT-PCR法检测大鼠肺组织生长因子（EGF）mRNA表达 右肺组织用Trizol提取总RNA。以逆转录试剂盒合成DNA，而后进行PCR扩增。按照NCBI Genebank数据库中EGF的基因序列，使用Prime Premier软件进行引物设计，并扩増片段到100-300bp的长度，由Invitrogen（上海）公司进行引物合成。EGF (PCR产物为165bp)上游引物：5’-CTGTTTCCCCTCATCTTTCC-3’； 下 游 引 物：5’-GTGCGTCTTAGTGGTATCTGTG-3’。此后进行实时定量PCR检测，在PCR仪上，将配置好的PCR反应溶液进行PCR扩増反应，扩增程序设定为：首先95 ℃预变性5 min；之后95 ℃变性30 s，循环40次，最后60 ℃退火45 s，冷却至55 ℃。

对各扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，之后使用凝胶图像分析软件Bandscan 4.5测定目的条带和GAPDH的灰度值，以GAPDH作为内参，计算目的基因条带与GAPDH条带灰度值比值，将其作为EGF mRNA的相对表达量（见表1），进行半定量分析，统计学处理。

2.4 统计学方法 所有数据均使用SPSS 17.0进行统计分析，结果用均数±标准差（x±s）表示，使用单因素方差分析（One-Way ANOVA）组间差异，以 P ＜ 0.05表示有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠肺组织的电镜结果 1）正常对照组（A组）：基底细胞、杯状细胞、柱状上皮细胞等上皮细胞形态基本正常，细胞器完整，细胞内顶端线粒体呈椭圆形，线粒体嵴完整清晰，基底膜无肿胀、无增厚，呈连续性。纤毛柱状上皮细胞结构正常，排列整齐，细胞间可见清晰的桥粒连接，正常微小管位于纤毛内。2）模型组（B组）：基底细胞、杯状细胞、柱状上皮细胞等上皮细胞的正常结构受损消失、变矮、变性，胶原纤维显著增多，纤毛变短脱落，微绒毛减少，有的细胞解体，细胞间隙增大，桥粒连接缺无，基底膜不连续，细胞萎缩，细胞内细胞核萎缩、融合，线粒体呈空泡样肿胀，其内浸润肥大细胞和嗜酸性粒细胞，嗜酸性粒细胞核膜及细胞膜完整，体积较大，大量嗜酸性蛋白颗粒存在于胞浆中，电子密度较高；肥大细胞内含均匀小粒，形态不一，核形不规则。3）布地奈德组（C组）：基底细胞、杯状细胞、柱状上皮细胞等上皮细胞变矮，损伤较模型组轻，细胞间可见胶原纤维增生，可见少量肥大细胞、嗜酸性粒细胞；部分纤毛变短减少、倒伏、闭塞坏死；线粒体呈空泡样变性；细胞间隙略增大，桥粒连接尚清晰完整，基底膜无明显增厚，基本连续。4）中药低剂量组（D组）：基底细胞、杯状细胞、柱状上皮细胞等上皮细胞变矮，损伤较模型组轻，细胞间可见胶原纤维增生以及少量肥大细胞、嗜酸性粒细胞，桥粒连结尚清晰完整，部分纤毛变短减少、倒伏、闭塞坏死；线粒体呈空泡样变性；基底膜无明显增厚，基本连续。5）中药中剂量组（E组）：基底细胞、杯状细胞、柱状上皮细胞等上皮细胞稍变矮，排列较规则，损伤较模型组明显减轻，细胞间未见肥大与嗜酸性粒细胞以及胶原纤维增生，桥粒连接接近正常，胞浆内细胞器结构基本完整，线粒体形态完整，基底膜呈连续性。6）中药高剂量组（F组）：与模型组相比较上皮细胞损伤减轻明显，细胞呈“舒展”状态，形态基本正常，细胞间未见肥大与嗜酸性粒细胞和胶原纤维增生，桥粒连接正常，胞浆内细胞器结构完整，纤毛闭塞坏死减少，排列整齐，线粒体结构、数量正常，溶酶体增多，基底膜无增厚，呈连续性。

3.2 大鼠肺组织EGF mRNA的表达 见表1。

表1 各组大鼠肺组织中EGF mRNA表达比较（x±s）

4 讨论

哮喘急性发作期在中医属于“哮证”范畴，祖国医学对于该病的认识主要源于《金匮要略》和《诸病源候论》，《金匮要略》中将其称为“上气”，是关于哮喘发作症状，最早的典型描述，将其归属为“伏饮”的范畴，正是因为这个提法后世绝大多数医家认为哮病的“夙根”是“顽痰伏肺”。在脏腑方面，肺脾肾三脏与“哮证”的关系最密切。肺司呼吸，可通调水道，脾主运化，能渗泄水湿，肾司前后二阴，通利水道，三脏通调，主上中下三焦之水湿，若失调，则水湿内停，痰饮内生，引发伏邪，致哮喘发作。导师刘建秋教授经过多年临床经验，结合历代医家的经验，认为哮喘患者由于反复发作导致“肺脾肾”虚损愈加严重，使得阳虚与痰浊相互交杂，属于“阳虚痰盛”证型，治疗以“温补肾阳，健脾补肺，祛痰平喘”为原则，总结出临床验方“平喘颗粒”，既能控制哮喘的发作，还能改善哮喘患者的临床症状。

从支气管哮喘的病理生理特征表现来讲，气道重塑的表现主要是由于气道的异常修复和反复损伤导致气道上皮发生损害和纤维化等基底膜增厚以及细胞外基质沉积的病变。从临床角度来分析，哮喘难以控制的原因主要是由于气道重塑与不可逆性气道阻塞、气道高反应性三者之间的恶性循环。表皮生长因子（EGF）是一类存在于人体内可促进或抑制多类细胞生长的多肽[5-6]，是分布于人体各腺体和体液中的常见物质，其性状相对稳定，但是血清中的含量较低。EGF可刺激表皮细胞等的增殖，哮喘气道重塑过程中EGF与其受体EGFR一起作用于气道重塑信号通路中的下游分子。异常刺激下，气道组织中EGF与高分泌的肝素结合，介导了气道重塑过程。而EGFR的下游的细胞信号通路激活主要是依赖于EGF与EGFR 的结合，二者的结合可进一步加重哮喘气道重塑[7]。

本实验研究通过观察哮喘大鼠肺组织的超微结构和EGF mRNA的蛋白表达情况，笔者发现平喘颗粒（低、中、高）组、布地奈德组和模型组EGF mRNA蛋白的表达均高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）。各治疗组EGF蛋白的表达较模型组明显降低，其中低剂量组与布地奈德组差异无统计学意义（P＞0.05）。由此可以推断平喘颗粒可以改善和控制气道重塑过程中气道高反应和气道阻塞的状态，并且可抑制EGF mRNA的表达，从而保护肺部组织细胞，减轻哮喘发作。同时通过实验还发现平喘颗粒还能影响气道周围血管的分布，这可能与气道周围的血管重塑也得到了抑制，其机理有待进一步研究。

[1] ROSCIOLI E, HAMON R, LESTER S, et al. Zinc-rich inhibitor of apoptosis proteins(IAPs) as regulatory factors in the epithelium of normal and inf l amed airways[J]. Biometals,2013, 26(2):205-227.

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Effect of Pingchuan granule on the expression of epidermal growth factor protein after airway remodeling in asthmatic rats

JIANG Pengna1, LIU Jianqiu2, LI Zhuying1,2,3*, WANG Xuehui2
(1. Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China;2. First Aff i liated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China;3. Key Laboratory of Chinese Materia Medica, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

Objective To investigate effect of Pingchuan granule on the expression of epidermal growth factor protein in asthmatic rats after airway remodeling by measuring the expression of epidermal growth factor protein after airway remodeling in asthmatic rats. Methods 90 Wistar rats were divided into 6 groups, 15 in each group, group A and group B were given normal saline by intragastric administration. Group C was inhaled with budesonide (0.5 mg of budesonide suspension, inhaled in compressed atomizer, twice daily), D, E and F were given low dose (4.01 g /kg/d), medium (8.01 g/kg/d) and high (16.02 g/kg/d). Each group was sacrif i ced 24 hours after the last excitation,and the lung tissue of the middle and lower part of the left lung was cut into 1mm × 1mm × 1mm size. The tissue was placed in an EP tube with 2.5% glutaraldehyde and fi xed for electron microscopy. Take part of the right lung tissue, PBS rinse dry water, liquid nitrogen frozen, placed in -80 ℃ refrigerator for RT-PCR detection. Results The expression of EGF mRNA protein in (the low、medium、high) dose Pingchuan granule group and Budesonide group and model group was higher than that in the blank group, and the difference was statistically signif i cant (p＜0.05).The expression of EGF mRNA protein in (the low, medium, high) dose Pingchuan granule group and budesonide group was signif i cantly lower than that in model group (p＜0.05). The expression of EGF mRNA protein in (the medium, high) dose Pingchuan granule group was signif i cantly lower than that in budesonide group but with no statis tical difference (P＞0.05). The expression of EGF mRNA protein in low dose Pingchuan granules group was lower than that in budesonide group, but the difference was not statistically signif i cant. Conclusion Pingchuan granule can improve and control the airway remodeling process of airway hyperresponsiveness and airway obstruction status, and can inhibit the expression of EGF mRNA, thereby protecting the lung tissue cells, reduce asthma attacks.

Pingchuan granule; airway remodeling; epidermal growth factor

R285.5

A

2095-6258(2017)06-0886-04

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.06.009

国家自然科学基金青年科学基金项目（81403234）;黑龙江省自然科学基金项目面上项目（H201481）;黑龙江中医药大学“优秀创新人才支持计划”项目（051268）;黑龙江中医药大学新药研究基金项目（2014xy04）;黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才培养计划（UNPYSCT-2015120）。

蒋鹏娜（1981 - ）,女,博士研究生,主要从事中西医结合呼吸系统疾病的诊治与研究。

*通信作者：李竹英,女,博士研究生导师,电话 - 13945056639,电子信箱 - lizhuying6808@ 126.com

2017-06-01）