HPLC法同时测定舒肝宁注射液中5种成分的含量Δ

支旭然，王觅，宋浩静，董占军（河北省人民医院药学部，石家庄050051）

HPLC法同时测定舒肝宁注射液中5种成分的含量Δ

支旭然＊，王觅，宋浩静，董占军#（河北省人民医院药学部，石家庄050051）

目的：建立同时测定舒肝宁注射液中5种成分含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Symmetry®C18，流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为238 nm（栀子苷、黄芩苷）、327 nm（绿原酸、野黄芩苷、黄芩素），柱温为30℃，进样量为10 μL。结果：绿原酸、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷检测质量浓度线性范围分别为0.406 2～26.0 µg/mL（r＝0.999 9）、2.500 0～160.0 µg/mL（r＝0.999 9）、6.562 0～420.0 µg/mL（r＝0.999 9）、0.312 5～20.0 µg/mL（r＝0.999 6）、0.585 9～37.5 µg/mL（r＝0.999 8）；定量限≤31.20 ng，检测限≤15.60 ng；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2.0%；加样回收率分别为97.72%～101.10%（RSD＝1.21%，n＝ 6）、97.67%～102.40%（RSD＝1.87%，n＝6）、97.64%～101.10%（RSD＝1.31%，n＝6）、96.45%～100.10%（RSD＝1.47%，n＝6）、96.16%～101.10%（RSD＝1.69%，n＝6）。结论：该方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于舒肝宁注射液中5种成分含量的同时测定。

高效液相色谱法；舒肝宁注射液；绿原酸；栀子苷；黄芩苷；黄芩素；野黄芩苷；含量

舒肝宁注射液是一种用于治疗急、慢性病毒性肝炎的纯中药复方注射制剂，具有清热解毒、利湿退黄、益气扶正和保肝护肝的功效[1-2]。舒肝宁注射液是依据《伤寒论》中茵陈蒿汤剂组方加减而成，经临床使用多年，疗效显著。作为全新的治疗急慢性病毒性肝炎的纯中药制剂，舒肝宁注射液以其高效、安全的特点成为临床保肝的较好选择[3]，在保护肝脏正常结构与功能方面有特效[4-5]。现代药学研究证明，舒肝宁注射液含多种黄酮类成分，水溶性强，生物利用度好，但目前关于舒肝宁注射液成分研究的报道较少[6-7]，且相关报道也仅检测了其中1～2种成分，显然不利于产品的质量控制。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）测定舒肝宁注射液中绿原酸、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷的含量，以为其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

2695型HPLC仪，包括2487双通道紫外-可见检测器（美国Waters公司）；BP211D型电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；XW-80A型旋涡混合器（上海精科实业有限公司）。

1.2 药品与试剂

舒肝宁注射液（贵州瑞和制药有限公司，批号：20150912、20150711、20160919、20160311、20160910，规格：2 mL/支）；绿原酸对照品（批号：LYS2015041901）、黄芩素对照品（批号：HQS2015071302）、野黄芩苷对照品（批号：YHQG2015032301）均购自南京春秋生物工程有限公司；栀子苷对照品（批号：MUST-16020401）、黄芩苷对照品（批号：MUST-16031811）均购自成都曼思特生物科技有限公司，所有对照品纯度均＞98%；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Symmetry®C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～23 min，25%→75%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：238 nm（栀子苷、黄芩苷）、327 nm（绿原酸、野黄芩苷、黄芩素）；柱温：30℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称定待测成分对照品各适量，加甲醇制成绿原酸、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷质量浓度分别为1.3、1.6、1.2、1.0、1.5 mg/mL的单一对照品贮备溶液。分别量取上述单一对照品贮备溶液适量，加甲醇制成绿原酸、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷质量浓度分别为 26.0、160.0、420.0、20.0、37.5 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密量取样品200 μL，置于10 mL量瓶内，加甲醇定容，经0.22µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按舒肝宁注射液处方和工艺制备缺茵陈、栀子、黄芩苷、野黄芩苷、黄芩苷的阴性样品，并按“2.2.2”项下方法制成缺绿原酸、缺栀子苷、缺黄芩苷和缺野黄芩苷、黄芩素的阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。结果，理论板数以绿原酸、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷峰计均＞5 000；分离度＞1.5，各成分基线分离良好。

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液，采用倍比稀释法，用甲醇逐级稀释，制成系列对照品溶液。精密量取上述系列对照品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以绿原酸、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归。回归方程与线性关系见表1。

2.5 定量限与检测限考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，当信噪比为10∶1时，得定量限；当信噪比为3∶1时，得检测限，详见表1。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，绿原酸、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷峰面积的RSD分别为 1.80%、1.02%、0.59%、1.34%、0.85%（n＝6），表明仪器精密度良好。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

表1 回归方程、线性范围与定量限、检测限Tab 1 Regression equation，linear ranges and limits of quantify，limits of detection

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：20150912）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，绿原酸、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷峰面积的RSD分别为0.89%、1.03%、1.89%、1.20%、1.25%（n＝7），表明供试品溶液室温放置12 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

精密称取样品（批号：20150912）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，绿原酸、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷峰面积的RSD分别为0.78%、0.69%、1.54%、1.13%、1.18%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量样品（批号：20150912）适量，共6份，分别加入一定质量的待测成分对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.10 样品含量测定

取5批样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果（n＝3，µg/g）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝3，µg/g）

3 讨论

查阅文献[8-9]可知，绿原酸检测波长为327 nm，栀子苷为238 nm，黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷可在275 nm检测定量。通过预试验发现，黄芩苷和野黄芩苷在238 nm和327 nm均可被检测，但黄芩苷在327 nm响应太高，标准曲线受影响；黄芩素在238 nm响应比较低，含量少时不易被检测。因此，本研究选用双波长238 nm（栀子苷、黄芩苷）和327 nm（绿原酸、黄芩素、野黄芩苷）检测，在此条件下，所需检测的各成分色谱峰分离度及峰形均佳，灵敏度较高。

舒肝宁注射液是由茵陈提取物、栀子提取物、黄芩苷、板蓝根提取物、灵芝提取物组合而成的中药注射液。茵陈药材中主要成分为绿原酸[10]；栀子药材中主要成分为栀子苷[11]；板蓝根药材中含有表依告春和腺苷[12]，预试验中表依告春没有检测到，腺苷同时也是灵芝的有效成分，不具有专一代表性[13]；本研究在测定黄芩苷的同时也检测到了野黄芩苷和黄芩素，从样品测定结果可以看出，野黄芩苷和黄芩素在不同批次中含量变化不大，猜测原料药黄芩苷不纯。因此，经过筛选，确定本试验检测绿原酸、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷作为舒肝宁注射液质量控制的主要研究成分。

本试验分别以甲醇-磷酸（0.05%、0.1%、0.4%）、甲醇-甲酸为流动相进行预试验。结果显示，采用甲醇-0.4%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱时，待测成分的分离效果和峰形良好，干扰成分少，基线平稳。

综上所述，本方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于舒肝宁注射液中5种成分含量的同时测定。

[1]梁海雄，黎丽群.舒肝宁注射液治疗慢性乙型病毒性肝炎临床研究Meta分析[J].世界中西医结合杂志，2016，11（8）：1057-1066.

[2]关妮.舒肝宁注射液临床应用进展[J].医学理论与实践，2014，27（10）：1291-1295.

[3]张瑾.舒肝宁注射液对顺铂中毒小鼠肝脏损伤的保护作用[J].中国药房，2016，27（7）：920-922.

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[5]陈端进.脱氧核苷酸钠联合舒肝宁注射液治疗肝损害的临床效果分析[J].海峡药学，2013，25（9）：130-132.

[6]曲彩虹，孟小斌，罗宇燕.HPLC测定舒肝宁注射液中绿原酸的含量[J].中药材，2013，36（6）：1014-1016.

[7]何峰，张昀.HPLC法同时测定舒肝宁注射液中表告依春和腺苷的含量[J].贵阳医学院学报，2015，40（12）：1338-1340.

[8]赵亮，王新霞，吕磊，等.HPLC法测定清肝散结颗粒中黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素[J].中成药，2014，36（2）：313-318.

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[10]曹锦花.茵陈的化学成分和药理作用研究进展[J].沈阳药科大学学报，2013，30（6）：489-494.

[11]孟祥乐，李红伟，李颜，等.栀子化学成分及其药理作用研究进展[J].中国新药杂志，2011，20（11）：959-967.

[12]任国萍，李铮，傅欣彤，等.HPLC法同时测定板蓝根药材中尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春和腺苷[J].中国新药杂志，2012，21（19）：2330-2334.

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Simultaneous Determination of 5 Components in Shuganning Injections by HPLC

ZHI Xuran，WANG Mi，SONG Haojing，DONG Zhanjun（Dept.of Pharmacy，Hebei Provincial People’s Hospital，Shijiazhuang 050051，China）

OBJECTIVE：To develop a method for the simultaneous determination of 5 components in Shuganning injections.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Symmetry®C18column with mobile phase consisted of methanol-0.4%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavlengths were set at 238 nm（geniposide，baicalin）and 327 nm（chlorogenic acid，baicalein，scutellarin）.The column temperature was 30 ℃ and the sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges were 0.406 2-26.0 µg/mL for chlorogenic acid（r＝0.999 9），2.500 0-160.0 µg/mL for geniposide（r＝0.999 9），6.562 0-420.0 µg/mL for baicalin（r＝0.999 9），0.312 5-20.0 µg/mL for baicalein（r＝0.999 6），0.585 9-37.5 µg/mL for scutellarin（r＝0.999 8）.The limits of quantify were no higher than 31.20 ng，limits of detection were no higher than 15.60 ng.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；the recoveries were 97.72%-101.10%（RSD＝1.21%，n＝6），97.67%-102.40%（RSD＝1.87%，n＝6），97.64%-101.10%（RSD＝1.31%，n＝6），96.45%-100.10%（RSD＝1.47%，n＝6），96.16%-101.10%（RSD＝1.69%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，precise，stable and reproducible，and can be used for simultaneous determination of 5 components in Shuganning injection.

HPLC；Shuganning injections；Chlorogenic acid；Geniposide；Baicalin；Baicalein；Scutellarin；Content

R917

A

1001-0408（2017）33-4702-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.26

政府资助省级临床医学优秀人才项目

＊药师，硕士。研究方向：药物分析与药动学。E-mail：zhixuran@163.com

#通信作者：主任药师，硕士生导师。研究方向：医院药事管理、中药质量控制。电话：0311-85988604。E-mail：hbghyxb123@163.com

（编辑：张 静）

2017-02-28

2017-04-25）