香樟叶斑病病原菌的分离与鉴定

徐明珠，罗欢，周志雄，贾国庚，邓建新，李传仁

(长江大学农学院，湖北 荆州 434025)

香樟叶斑病病原菌的分离与鉴定

徐明珠，罗欢，周志雄，贾国庚，邓建新，李传仁

(长江大学农学院，湖北 荆州 434025)

香樟叶斑病是近年来荆州市香樟树Cinnamomumcamphora的一种常发病害，褐色坏死斑点1～2 mm，常两个至多个相互连接形成不规则病斑，遍布于整个叶片，严重影响香樟的正常生长。根据柯赫法则对感病组织进行分离、接种、再分离，再对获得的病原菌进行形态观察和rDNA-ITS、TUB-2和GPDH基因序列分析，结果表明引起香樟叶斑病的病原菌为炭疽菌属Colletotrichum的果生刺盘孢C.fructicola和暹罗刺盘孢C.siamense，属于国内首次报道。

香樟;叶斑病；病原菌；分离；鉴定

香樟Cinnamomumcamphora(L.) Presl.为亚热带常绿乔木，具芳香，广泛分布于亚洲东南部。在我国，该树种主要集中在长江流域及以南地区[1]，属于我国重要的经济树种，也是城市园林绿化的优良树种，其传统用途主要包括园林绿化和装饰、木材(建筑，家具和雕塑)、医药、杀虫和驱虫剂等。调查研究表明，香樟已被我国36个城市选为市树，在传统文化和宗教信仰方面也具有重要的应用价值[2]。随着香樟种植面积的加大，病害问题也随之而来。

近年来，荆州市道路绿化香樟常发生较为严重的叶斑病，严重影响香樟的正常生长。为此，作者通过组织分离法对病原菌进行分离、培养与致病性检测试验，并利用形态学和多基因位点序列分析的方法进行分类鉴定，旨在明确其种类，为科学防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料：2016年5月，采于湖北省荆州市荆州区荆秘路长江大学西区附近的感病香樟树。

试剂：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA，Difco，美国)、合成低营养培养基(synthetic low nutrient agar，SNA)[3]、次氯酸钠溶液(天津天力化学试剂有限公司)、引物(ITS5和ITS4、Bt2a和Bt2b、GDF和GDR)由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。

仪器：PCR仪(Veriti，ABI vertical，美国)、显微成像系统(Eclipse Ci-E，尼康，日本)、打孔器(6 mm)。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离与纯化 将具有典型症状的病叶冲洗干净后，在病健交界处切取2～3 mm的组织块，浸入4%次氯酸钠溶液中消毒2 min，然后用无菌水冲洗3次，置于无菌滤纸上吸干表面残留水分，再转移至PDA(Difco)培养基上，置于25 ℃恒温培养箱中培养。待长出菌丝后，从菌落边缘挑取菌丝，转接到新的PDA培养基上继续恒温培养，对所分离的菌株进行进一步纯化和形态观察。纯培养物斜面培养后放入4 ℃保存备用。

1.2.2 病原菌致病性检测 从分离病原菌的香樟树上，选取健康嫩叶，自来水冲洗干净，用2%次氯酸钠表面消毒2 min，然后无菌水清洗3次，无菌滤纸吸干表面水分，放置于无菌高湿的保鲜盒中。将分离到的所有纯化菌株在PDA培养基上培养3～5 d，用无菌打孔器在菌落边缘切取6 mm菌丝块，放置于保鲜盒中的香樟叶片上，以空白的PDA培养基作对照。盖上盒盖，放置于25 ℃恒温培养箱培养，3 d后观察发病情况。发病后，从病斑上再次分离病原物，检测是否与接种菌株相同。试验共重复3次。

1.2.3 病原菌形态学观察 将菌株接种于PDA培养基上，形成菌落后，用灭菌后的打孔器切取菌落边缘直径为6 mm的菌丝团块，转移到PDA平板(直径90 mm)中央。在黑暗条件下，25 ℃恒温培养7 d，观察菌落形态、测量菌落大小。同时，在PDA菌落上挑取少量菌丝团块，转接于SNA培养基中央，并在四周放置无菌盖玻片用以产生附着胞。在无光照条件下，25 ℃恒温培养7 d，以水为介质，显微镜下观察分生孢子形态，随机测量50个分生孢子的大小，并观察盖玻片上附着胞的形态，测量其大小。

1.2.4 DNA提取、PCR扩增及序列测定 将分离菌株在PDA培养基上培养5～7 d后，从菌落上刮取菌丝团块，放入1.5 mL离心管中，冷冻干燥后，利用CTAB法提取总DNA[4]。对其核糖体转录间隔区(rDNA-ITS)，β-微管蛋白(TUB-2)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPDH)等3个基因片段进行PCR扩增，所用引物分别为ITS5和ITS4[5]、Bt2a和Bt2b[6]、GDF和GDR[7]，均由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。采用体积为40 μL的2×Taq预混PCR反应体系(Genstar，北京康润诚业生物科技有限公司)，参考王薇 等[8]的条件。扩增产物与新型核酸染料(GoldenView，北京博迈德基因技术有限公司)混合，经过琼脂糖凝胶电泳检测后，对已扩增好的产物委托南京金斯瑞生物技术有限公司进行序列测定。

1.2.5 多基因位点序列分析 将所获得的供试菌株YZU 161002和YZU 161027的基因序列在NCBI网站进行BLAST比对，根据比对的初步结果，选用Weir等[9]盘长孢状刺盘孢菌复合群中的模式菌株或权威菌株序列与本研究的供试菌株进行序列分析。利用Mega v5.03软件中的ClustalW程序对单个基因序列进行校排(alignment)，并对多个基因序列进行连接合并。利用RAxML软件中的GTRCAT模型，重复1000次的自举分析(bootstrap)，将Colletotrichumclidemiae设为组外对照，构建ML(Maximum Likelihood)系统发育树。

2 结果与分析

2.1 香樟叶斑病症状 荆州市香樟叶斑病，多表现为褐色坏死斑点1～2 mm，常两个至多个相互连接形成不规则形病斑，遍布于整个叶片(图1A，B)，严重时叶片枯死，脱落。

A.病叶正面;B.病叶背面图1 香樟叶斑病症状

2.2 致病性 经初步菌落形态观察，从香樟病叶上分离获得的菌株可分为两大类群，未分离到其它菌物。致病性检测发现所有菌株均可引起健康香樟叶片发病，对照组未见发病。第3天起已出现褐色病斑，随后病斑上产生灰色菌丝，7 d后致病结果如图2所示，有些病斑上会产生粉红色粘质孢子堆(图2C)。从这些病斑上再次分离病原菌，发现所获得分离物与接种菌一致，表明所分离的菌株均为引起荆州市香樟叶斑病的病原菌。

C.菌株YZU 161002;D.菌株YZU 161027图2 致病性检测症状

2.3 病原菌的分离结果与形态特征 根据所分离到的病原菌菌株在PDA上的菌落特征及SNA上的形态特征，获得形态一致的两个类群，即两个种类。要把这两个种类鉴定到种非常困难，但是可确定两株菌均为盘长孢状刺盘孢菌复合群(C.gloeosporioidesComplex)中的种类，如表1所示。

表1 香樟叶斑病病原菌与盘长孢状刺盘孢菌复合群种类的形态学比较

对两个类群中的代表菌株YZU 161002和YZU 161027进行进一步的形态学观察，结果为：

菌株YZU 161002在PDA上25 ℃暗培养的菌丝呈辐射状生长，速度较快，菌落絮状平铺，初期白色或灰白色，渐变为浅灰色至橄榄绿色，后期中央菌丝团块有粉红色孢子堆出现，7 d后菌落直径大小为82～84 mm，背面灰色至深橄榄绿色；在SNA上25 ℃暗培养7 d后，分生孢子长椭圆形、无色、单胞、常见一端钝圆，一端略尖锐，大小为(10～21)×(3～8)，附着胞深褐色，近球形、椭圆形、长椭圆形或三角形，边缘不规则，大小为(7～15)×(6～9)μm(图3)。

A.在PDA上的菌落形态;B.在SNA上的分生孢子;C-D.附着胞图3 香樟叶斑病病原菌菌株YZU 161002的形态特征

菌株YZU 161027在PDA培养基上，菌丝绒毛状辐射生长，菌落白色，背面黄白色，7 d后菌落直径大小为77～79 mm；在SNA上25 ℃无光照培养7 d后，分生孢子单胞、长椭圆形、无色、大小为(10～19.5)×(4～6.5)μm，附着胞卵形近不规则圆形、椭圆形或近球形，深褐色，大小为(7～14)×(5～7)μm(图4)。

A.在PDA上的菌落形态;B.在SNA上的分生孢子;C-D.附着胞图4 香樟叶斑病病原菌菌株YZU 161027的形态特征

2.4 多基因位点序列分析 对香樟叶斑病的两个病原菌菌株YZU 161002 和YZU 161027的rDNA-ITS、TUB-2和GPDH三个基因进行PCR扩增测序后，分别获得577 / 576 bp，416 / 416 bp，280 / 277 bp大小的序列，其GenBank登录号见表2。

表2 构建系统发育树所用长孢状刺盘孢菌复合群菌株的种类、寄主及GenBank登录号

利用三个基因拼接起来进行序列分析，并构建ML系统发育树如图5所示。

结果表明，菌株YZU 161002与果生刺盘孢Colletotrichumfructicola菌株聚集在一起，菌株YZU 161027与暹罗刺盘孢C.siamense菌株聚集在一起，与其它相近种可明显区分开来。这两个种类均属于盘长孢状刺盘孢菌复合群(C.gloeosporioidesComplex)，因此，根据分子鉴定的结果，结合形态学观察，确定这两个类群的菌株分别为Colletotrichumfructicola和C.siamense。

图5 基于rDNA-ITS，TUB-2和GPDH基因序列构建的ML(maximum likelihood)系统发育树

3 结论与讨论

本研究通过形态学、分子生物学及致病性检测，证明了引起荆州市香樟叶斑病的病原菌为炭疽菌属真菌Colletotrichumfructicola和C.siamense。这两个种类是在2009年由Prihastuti等[10]从泰国南部健康咖啡浆果和病果上分离获得，并首次报道为新种。2012年，有报道认为这两个炭疽菌种类可侵染很多植物，引起植物发病，造成经济损失。无独有偶，这两个种类共同也可引起桃子[12]、辣椒[15]、油茶[16]等炭疽病发生。早期研究发现炭疽菌Colletotrichum可引起香樟和芳香樟发病，在叶部常表现症状为褐色斑点，形态学鉴定为胶胞炭疽菌C.gloeosporioides，又称盘长孢状刺盘孢菌[17-18]。但是，基于分子系统发育研究表明，过去形态学上的胶胞炭疽菌不只是一个种，而是一个盘长孢状刺盘孢菌复合群(C.gloeosporioidescomplex)，共包含22个种和一个亚种[9]，包括C.fructicola和C.siamense。

盘长孢状刺盘孢菌复合群的种类形态之间非常相似，种内易存在差异性，目前培养的方法和条件相对比较混乱，准确的分类鉴定必须辅之以分子生物学方法。rDNA-ITS、ACT、TUB-2和GPDH等均为炭疽菌分子系统发育研究常用基因序列[9-14]。本研究通过三种常用基因(rDNA-ITS、TUB-2和GPDH)分析研究同样发现，多基因位点序列分析可明确鉴定盘长孢状刺盘孢菌复合群内种类。

葛建明 等[17]描述的上海地区香樟炭疽病的病原菌和王丽贞[18]所报道的福建省三明市芳香樟炭疽病的病原菌经形态学鉴定为胶胞炭疽菌C.gloeosporioides，此结果需要通过分子生物学方法再次核验。本研究首次通过形态学和分子系统发育分析证明了香樟叶斑病是由两种炭疽菌引起，为该叶斑病的有效防治提供了理论依据。

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(责任编辑 李计顺)

IsolationandidentificationofthepathogenfromtheleafspotdiseaseonCinnamomumcamphora

/XU Mingzhu,et al.

(College of Agriculture,Yangtze University,Jingzhou 434025,China)

Leaf spot disease onCinnamomumcamphoraoccurred severely and frequently in Jingzhou,Hubei province in recent years.The disease had the brown necrotic spot with 1-2 micrometers in length,two or more spots connected to perform a big spot in irregular shape and diffused onto the whole leave.It was strongly harmful to the growth of camphor.Based on Kohn′s rule,the author finished the isolation,inoculation and re-isolation for the infected tissues,and then observed the morphology of the isolated pathogen and conducted gene sequence analysis of rDNA-ITS,TUB-2 and GPDH.The results showed that the pathogens wereColletotrichumfructicolaandC.Siamense,both of them were firstly reported in China.

Cinnamomumcamphora;leaf spot disease;pathogen;isolation;identification

2016-12-09；

2017-02-21

国家自然科学基金项目(31400014)；长江大学青年人才基金项目(2015cqr17；2016cqr08)

徐明珠(1991—)，女，湖北荆州人，汉族，硕士在读，从事园艺植物研究

邓建新，男，副教授，从事植物真菌病害研究，E-mail：djxin555@hotmail.com；李传仁，男，教授，主要从事昆虫学研究，E-mail：lichuanren63@163.com。

S763.15

A

1671-0886(2017)04-0021-05