人S100A8和S100A9原核载体的构建、鉴定及蛋白纯化

郭雷鸣，丁高峰，徐文才，陈淅涓，蒋月，陆寓非

人S100A8和S100A9原核载体的构建、鉴定及蛋白纯化

郭雷鸣，丁高峰，徐文才，陈淅涓，蒋月，陆寓非

目的分别构建人 S100A8（hS100A8）和 S100A9（hS100A9）的 PET-28a 原核表达载体，并纯化 hS100A8和 hS100A9 蛋白，为进一步研究 hS100A8 和 hS100A9蛋白的分子生物学功能奠定实验基础。

方法用带酶切位点的引物从 hS100A8 和 hS100A9 的真核表达载体扩增 hS100A8 和 hS100A9 基因片段，用相同的限制性内切酶双酶切 PCR 产物和 pET-28a 质粒。将两者用 T4 连接酶连接后转化入感受态细胞 DH5α，提取质粒进行鉴定。将构建成功的 pET28a-hS100A8 和pET28a-hS100A9 分别转化感受态细胞 BL21，诱导蛋白表达，将等量纯化蛋白在一定钙离子浓度下室温孵育 30 min，通过 SDS-PAGE 和 Western blot 验证异源二聚体是否形成。

结果正确扩增出 hS100A8 和 hS100A9 基因，重组质粒pET28a-hS100A8 和 pET28a-hS100A9 构建成功，纯化后在室温孵育后可形成异源二聚体。

结论hS100A8 和 hS100A9 蛋白可以在体外形成异源二聚体，为探讨其生物学作用奠定理论基础。

钙粒蛋白 A； 钙粒蛋白 B； 基因表达

hS100A8 和 hS100A9 属于 S100 家族的成员，是细胞内小分子量钙结合蛋白，在细胞内/外发挥多种生物学功能，在炎症相关癌变研究领域中作用机制多有研究，它们在癌变的起始、促进和演变的每一阶段均发挥着重要作用[1]。hS100A8 和hS100A9 在细胞内的表达具有组织特异性[2]，是髓系细胞分化过程中表达的具有免疫原性的蛋白质[3]，在粒细胞和单核细胞中的表达量较高，主要定位在胞浆，两者常以钙离子依赖方式形成异源二聚体hS100A8/A9[4]。hS100A8/A9 是细胞内发挥作用的主要形式[5]，起着促进细胞趋化反应、抗菌、抑制多种正常细胞（成纤维细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等）和肿瘤细胞（白血病细胞、淋巴瘤细胞、乳腺癌细胞等）生长的作用[6]。hS100A8/A9 作为重要的致炎介质参与急性、慢性炎症反应，在多种肿瘤细胞和浸润的免疫细胞中均有表达，具有致炎因子作用[7]。同时，可与多不饱和脂肪酸花生四烯酸（arachidonic acid，AA）特异性结合形成hS100A8/A9-AA复合体，并作为转运蛋白将 AA转运至靶细胞，参与 AA 细胞代谢通路[8]，hS100A8/A9 的异常表达在慢性炎症相关的肿瘤发生过程中发挥着重要的作用[9]。

hS100A8 和 hS100A9 即是免疫细胞产生的炎性因子，也是促凋亡因子，其作用机制十分复杂。尽管有关 hS100A8 和 hS100A9 研究较多，但它们潜在的生理和病理意义还不甚明确。因此，我们构建 hS100A8 和 hS100A9 原核表达载体，旨在制备纯化的 hS100A8 和 hS100A9 蛋白，为进一步研究其生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒 大肠杆菌 DH5α、BL21（DE3）、质粒 pET28a 由郑州大学基础医学院微免教研室提供；真核载体 pcDNA3.1-hS100A8-Myc和 pcDNA3.1-hS100A9-Flag 由德国癌症研究中心Mayer 教授馈赠。

1.1.2 主要试剂 PCR 所用试剂、DNA 连接试剂盒、DNA marker 和限制性内切酶BamH I 和XhoI 购自 Fermentas 公司；胶回收和 DNA 纯化回收试剂盒购自北京 TransGen 公司；抗 hS100A8抗体 Calgranulin A（C-19）、抗 hS100A9 抗体Calgranulin B（C-19）、抗 hS100A8/A9 抗体Calgranulin A/B（27E10）均购自美国 Santa Cruz Biotechnology 公司；羧苄青霉素和卡那霉素、Ni-NTA His Bind 树脂购自德国 Novagen 公司；IPTG 购自美国 Sigma 公司；DAB 显色试剂盒购自北京博士德生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 hS100A8 和 hS100A9 原核表达载体构建1.2.1.1 PCR 扩增 hS100A8 和 hS100A9 基因片段 将真核表达载体 pcDNA3.1-hS100A8 和pcDNA3.1-hS100A9 分别转化入感受态细胞大肠杆菌 DH5α，接种于含 60 μg/ml 羧苄青霉素的 LB平板，37 ℃ 过夜培养，挑选单个菌落，用 10 ml LB细菌培养基，加入羧苄青霉素（终质量浓度是60 μg/ml），37 ℃、270 r/min 于空气浴摇床过夜后提取质粒，测取质粒浓度后，-20 ℃ 保存待用。

以质粒 pcDNA3.1-hS100A8 为模板设计含BamH I/XhoI 酶切位点的引物：上游引物：5' TCA GGATCC ATGTTGACCGAGCTGGAGAAAGCCT 3'（下划线为BamH I 酶切位点），针对 hS100A8 片段的起始密码区；下游引物：5' CCGCTCGAG AG ACTCTTTGTGGCTTTCTTCA 3'（下划线为XhoI酶切位点），针对载体的 56 ～ 334 bp 片段。以质粒pcDNA3.1-hS100A9 为模板设计含BamH I/XhoI酶切位点的引物：上游引物 5' TCAGGATCC A TGACTTGCAAAATGTCGCAGCTGG 3'（下划线为BamH I 酶切位点），针对 hS100A9 片段的起始密码区；下游引物：5' CCGCTCGAG TCCGGGG

GTGCCCTCCCCGAG 3'（下划线为XhoI 酶切位点），针对载体的 46 ～ 387 bp 片段。引物由上海生工公司合成。以提取的纯化质粒为模板，PCR扩增 hS100A8 和 hS100A9 目的片段，具有hS100A8 和 hS100A9 基因片段和BamH I 及XhoI 两个酶切位点，产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳分离，DNA 回收试剂盒回收 hS100A8 和hS100A9 片段。

1.2.1.2 原 核 载 体 pET28a-hS100A8 和pET28a-hS100A9 的构建 用BamH I 和XhoI分别双酶切 hS100A8 和 hS100A9 片段及 pET28a质粒，酶切产物经纯化后用 DNA 连接试剂盒将hS100A8 和 hS100A9 片段分别与 pET28a 连接，构建成原核表达载体，命名为 pET28a-hS100A8 和pET28a-hS100A9。连接产物转化入感受态细胞大肠杆菌 DH5α，接种于含 50 μg/ml 卡那霉素的 LB平板，37 ℃ 过夜培养，挑选单菌落，再次涂布在含50 μg/ml 卡那霉素的 LB 平板进行分区二次抗生素筛选，37 ℃ 过夜培养，分别挑选 pET28a-hS100A8和 pET28a-hS100A9 的 20 个生长良好的菌落进行热裂解提取质粒，并将提取的质粒做 PCR 鉴定，挑取扩增出目的条带的菌落，加入 10 ml 含 50 μg/ml卡那霉素的 LB 培养基，37 ℃、280 r/min 摇床培养过夜后，用碱裂解法提取质粒，并用BamH I 和XhoI 进行双酶切鉴定，同时送北京鼎国生物公司进行测序。

1.2.2 hS100A8 和 hS100A9 蛋白纯化及鉴定

1.2.2.1 诱导 hS100A8 和 hS100A9 蛋白的表达 将原核表达载体 pET28a-hS100A8 和pET28a-hS100A9 分别转化入感受态大肠杆菌BL21 菌株，涂含卡那霉素的 LB 培养基平板 37 ℃过夜，挑取分隔良好的单个菌落，加入 8 ml 含50 μg/ml 卡那霉素的 LB 培养基，37 ℃、280 r/min摇床过夜，第 2 天取新摇菌管，加入含同样抗生素的 LB 培养基 100 ml，37 ℃、280 r/min 空气摇床振摇培养 2 ～ 3 h，直至细菌达到对数生长期即菌液OD600= 0.6 ～ 0.7 时开始，分成 3 组，分别用0.4、0.7、1.0 mmol/L IPTG 诱导，每组 3 支，分别于 16、24、37 ℃ 空气浴摇床振摇，选择最佳培养条件。按照 1 mmol/L IPTG、16 ℃ 诱导培养16 h 的最佳培养条件，大规模诱导细菌表达后，取2 ml 菌液，4 ℃、4 000 r/min 离心 10 min，弃上清，用预冷的 40 μl 细菌裂解液进行重悬，并用超声裂解细菌，再于 0 ℃、12 000 r/min 离心 30 s，取 40 μl 上清，加入 5 × SDS 加样缓冲液 10 μl，沉淀部分加入 5 × SDS 加样缓冲液 10 μl，100 ℃煮沸 10 min。分别取 30 μl 进行 SDS-PAGE 电泳分析目的蛋白，鉴定两种蛋白是否以可溶形式表达。

1.2.2.2 纯化 hS100A8 和 hS100A9 蛋白 收集经扩增的菌体，加入裂解缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，0.2 % SDS，0.1%溴酚蓝，10% 甘油），待菌体裂解后，收集菌液，4 ℃、12 000 r/min 离心 20 min 后，收集上清液，经 His 亲和层析柱纯化，最后一次洗脱前每毫克融合蛋白加入 10 U 凝血酶，收集流出液，进行SDS-PAGE 电泳鉴定。将 100 μl 苯甲脒琼脂糖凝胶试剂加入纯化的 hS100A8和 hS100A9 中除去凝血酶，反应 20 min 后离心，已纯化蛋白透析分装后冷冻干燥，放于 -80 ℃ 冰箱备用。

1.2.2.3 hS100A8/hS100A9 鉴定 用含1.3 mmol/L 钙离子的 Hanks-Hepes 液溶解蛋白，使用增强型 BCA 蛋白测定试剂盒检测每种样品的蛋白质浓度后，取等量的 hS100A8、hS100A9 蛋白（各 20 μg）溶解混合，室温放置 30 min，分别加入适量的 5 × loading buffer，经 10% SDS-PAGE电泳进行分离，然后按标准电泳方法转移到 PVDF膜上[10]。用 5% 牛血清白蛋白（BSA）在 PBS 缓冲液中封闭 2 h 后，用 1 × TBST 溶液摇床清洗3 次，10 min/次。将膜浸泡于 TBST 稀释的一抗溶液中（anti-β，anti-S100A8，anti-S100A9，anti-S100A8/A9 1∶1000），4 ℃ 过夜，再次 TBST溶液摇床清洗 3 次，10 min/次。将膜与 TBST 稀释的二抗溶液中（1∶2000），室温下孵育 2 h，TBST清洗 5 次，5 min/次，最终采用 DAB 显色法进行分析。

2 结果

2.1 hS100A8 和 hS100A9 基因扩增产物的鉴定

用带酶切位点的引物 PCR 从真核表达载体pcDNA3.1-hS100A8 和 pcDNA3.1-hS100A9 成功扩增出 hS100A8 和 hS100A9 片段（图 1），目的片段 hS100A8 约 280 bp，hS100A9 约 340 bp。

图 1 hS100A8 和 hS100A9 PCR 扩增产物电泳图Figure 1 Electrophoretic profile of PCR product of hS100A8 gene and hS100A9 gene

图 2 pET28a-hS100A8（A）和 pET28a-hS100A9（B）重组质粒测序报告图Figure 2 pET28a-hS100A8(A) and pET28a-hS100A9 (B) recombinant plasmid sequencing report

图 3 pET28a-hS100A8（A）和 pET28a-hS100A9（B）质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定Figure 3 Identification of pET28a-hS100A8 (A) and pET28a-hS100A9 (B) by agarose gel electrophoresis

2.2 原核载体 pET28a-hS100A8 和 pET28ahS100A9 的构建

pET28a-hS100A8 和 pET28a-hS100A9 重组质粒测序结果如图 2 所示。

2.3 原核载体 pET28a-hS100A8 和 pET28ahS100A9 的鉴定

用BamH I 和XhoI 分别双酶切原核载体pET28a-hS100A8 和 pET28a-hS100A9，进行 2%琼脂糖凝胶电泳，可以看到两条带，大小分别为4900 bp 与 282 bp（图 3），与预期大小一致。pET28a-hS100A8 和 pET28a-hS100A9 由北京鼎国生物公司送至上海生工公司进行测序，将测序结果与 GenBank 中 S100A8 基因序列（GenBank acc.no.NM-002964.3）和 S100A9 基 因 序列（GenBank acc.no.NM-002965.2）进行对比。结果表明，S100A8 基因从 170 ～ 450 bp 完全相同，长度约 280 bp；S100A9 基因从 165 ～ 510 bp 完全相同，长度约 345 bp；说明质粒构建成功。

2.4 hS100A8 和 hS100A9 蛋白的体外纯化

Western blot 分析显示 hS100A8 和 hS100A9的原核表达转化的菌体表达了蛋白（图 4），而未经诱导的菌体则无此条带出现，说明 S100A8 和S100A9 蛋白两者能够在体外表达；且经SDS-PAGE 电泳及 Western blot 检测到特异的hS100A8/A9 的条带，说明 hS100A8 和 hS100A9形成异源二聚体。

图 4 Western blot 分析原核载体表达的 hS100A8 和hS100A9 蛋白Figure 4 Western blot analysis the prokaryotic vector expression protein of hS100A8 and hS100A9

3 讨论

S100 蛋白家族是钙结合蛋白家族中最大的亚类，能够与钙离子结合，通过钙离子信号转导途径，在细胞增殖、分化及细胞凋亡中发挥重要生物学作用[11]。目前慢性炎症与肿瘤发生之间的关系逐渐受到关注，hS100A8/A9 既是一种炎性介质，在肿瘤中又有促进癌细胞凋亡的作用。本课题组前期研究结果表明：hS100A8 和 hS100A9 在食管鳞癌组织中表达下调[12]，且低分化细胞下调更明显，甚至不表达[13]；另一方面，将真核载体 pcDNA3.1/MychS100A8-His 和 pcDNA3.1-hS100A9-Flag 转染食管癌细胞株有少量的蛋白表达，对细胞的影响不甚明显，需要用大量的 hS100A8/A9 蛋白刺激细胞株来观测细胞发生的变化。因此，体外形成其异源二聚体对进一步研究 hS100A8/A9 的功能及其对肿瘤细胞生物学行为的影响具有重要意义。

为了制备纯化的 hS100A8/A9 蛋白，本研究中选用 pET28a 作为表达载体，该载体含有 T7 启动子，是一个强启动子，可以使目的基因高效率地表达。同时将 pET28a 的 6·His-Tag 作为纯化标记，将其加入到蛋白的 N-末端，使表达的融合蛋白只经亲和层析一步即可纯化，不仅简化了纯化蛋白的步骤，而且蛋白 N-末端组氨酸不会改变目的蛋白的活性。另利用 6·His-Tag 采用 Ni-NTA 柱亲和层析法纯化目的蛋白，并对其蛋白质性质进行初步研究，确定了 hS100A8 和 hS100A9 纯化时所需最佳培养条件：1 mmol/L IPTG、16 ℃、16 h。以上表明 pET28a-hS100A8 和 pET28a-hS100A9 重组表达载体能使 hS100A8 和 hS100A9 基因和原核载体 pET28a 充分发挥各自的优良特性，大大提高了hS100A8 和 hS100A9 蛋白的纯化率。重组人hS100A8 和 hS100A9 原核表达与纯化实验技术的建立，将为进一步研究 hS100A8 和 hS100A9蛋白在胞外信号传递以及肿瘤发生，增殖和转移方面生物学调控提供必要的实验基础。S100 家族蛋白有很多相似的特征，例如分子量都是 10 ～12 kD，在中性溶液中都是酸性蛋白。因此，本实验技术可以对纯化 S100 家族其他蛋白具有重要的参考意义。

根据文献[10]报道，大肠杆菌表达系统表达纯化出的 hS100A8 和 hS100A9 蛋白均为可溶形式。本研究于天然条件下纯化得到了目的蛋白，保持了蛋白的生物活性，并在体外成功构建了异源二聚体 hS100A8/A9。由于异源二聚体 hS100A8/A9的相对分子质量与 hS100A9/A9 同源二聚体的相对分子质量接近，因此仅从 SDS-PAGE 电泳无法明确该条带是否为 hS100A8/A9。为进一步确定，我们采用 Western blot 法用抗 hS100A8/A9 的抗体孵育，此抗体特异性识别异源二聚体hS100A8/A9，而对同源二聚体 hS100A9/A9 不能识别。由 hS100A8/A9 抗体检测到的在相对分子质量 27 kD 处出现的特异条带应为 hS100A8/A9，说明 hS100A8 和 hS100A9 经上述处理后，可形成异源二聚体。为下一步研究 hS100A8/A9 的生物学功能奠定了基础。

研究发现 hS100A8/A9 异源二聚体比组成该二聚体的每个亚基的活性都高[14]，hS100A8/A9 是免疫细胞产生的有效的炎性因子，也是有力的促凋亡因子。因此有关 hS100A8/A9 功能的研究是该领域的一个焦点。其作用机制十分复杂，虽已取得部分进展，还有待进一步深入研究。本实验研究结果表明 hS100A8/A9 蛋白可以在体外表达并纯化，但是两者在肿瘤性疾病中存在差异表达且功能多样。在食管鳞癌癌变不同时期的组织中，hS100A8/A9的表达水平随病变程度的加重而逐渐降低[15]，并与肿瘤的临床病理分级之间存在显著的相关性。hS100A8/A9 的表达下调常伴随着核浆转位现象的出现，表明它们的下调是食管鳞癌发生和发展过程中一个普遍事件，hS100A8/A9 将可能作为食管鳞癌发生和发展过程中较为理想的分子标志物用于今后的诊断、治疗和预后监测。下一步打算用体外纯化的不同浓度的 hS100A8/A9 蛋白去刺激不同分化程度的食管鳞癌细胞株，用 SDS-PAGE 电泳和 Western blot 检测下游通路的蛋白变化，初步讨论 hS100A8/A9 在慢性食管炎相关食管鳞癌形成过程中的作用机制，为进一步探讨慢性炎症与食管鳞癌发生的关系，为食管鳞癌的有效的早期防治、降低发病率提供重要的实验依据。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(6):520-525

Construction, identification and purification of recombinant prokaryotic expression vector expressing human S100A8 and S100A9

GUO Lei-ming, DING Gao-feng, XU Wen-cai, CHEN Xi-juan, JIANG Yue, LU Yu-fei

ObjectiveTo construct recombinant prokaryotic expression vector expressing human S100A8 (hS100A8) and human S100A9 (hS100A9), then purified recombinant hS100A8 and hS100A9 proteins, for further studying human its molecular biology effects.

MethodsUse the same restriction endonuclease double enzyme digestion PCR products and pET-28a plasmid, both connected with T4 ligase, then transformed into competent cell DH5α, extraction of plasmid for identification. The recombinant plasmid pET28a-hS100A8 and pET28a-hS100A9 was confirmed by restriction endonuclease digestion, PCR and gene sequencing, then the resultant vectors respectively transformed into competent cell BL21. Induced the protein expression then isometric purified protein on calcium ion concentration must incubate for 30 min, by SDS-PAGE and Western blot methods validation of heterologous dimer formation.

ResultshS100A8 and hS100A9 gene was amplified accurately. Prokaryotic expression vector pET28a-hS100A8 and pET28a-hS100A9 were constructed successfully, and expressed in competent cell fromEscherichia coliBL21, after purified at room temperature can be formed after incubation heterologous dimers.

ConclusionThe recombinant prokaryotic expression vectors expressing hS100A8 and hS100A9 was successfully constructed, and can form the heterologous dimersin vitro. These will be used to investigate the biological role of hS100A8 and hS100A9.

Calgranulin A; Calgranulin B; Gene expression

Author Affiliation:Department of Radiotherapy, Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University/Henan Cancer Hospital, 450001 Zhengzhou, China

LU Yu-fei, Email： lyf890@sina.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.06.005

河南省科技攻关计划项目（201503187）；国家自然科学基金（81372436）；河南省卫生厅省部共建项目（201201009）

450001 郑州大学附属肿瘤医院放疗科

陆寓非，Email：lyf890@sina.com

2017-09-27

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2017, 12(6):520-525