大豆根瘤共生固氮分子机制研究进展

侯云龙++高淑芹++马晓萍++陈健++邱红梅++王跃强

摘 要：大豆的共生固氮能力得益于根瘤，根瘤数与固氮效率是典型的数量性状受多基因调控。目前，已经在大豆中克隆到結瘤因子（Nodular Factor，NF）的关键受体，以及一些在结瘤信号传导途径中的分子组分，这些组分涉及到结瘤基因、肽类激素、受体激酶和小的信号代谢产物。其中部分基因的功能及作用机理得以阐明，参与的共生固氮途径及部分节点也已明晰。

关键词：大豆根瘤；共生固氮；机制研究；进展

中图分类号：S-1 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20171132011

共生固氮是一个极其复杂的生物过程，它是由根瘤菌与寄主植物互作产生的，主要过程为寄主根部产生类黄酮，吸引根瘤菌附着于根毛，产生并释放NF，被寄主的NF受体识别，产生钙峰信号—结瘤信号，根毛变形弯曲包裹根瘤菌，根瘤菌侵入后通过宿主植物中所形成的一些管状结构达到宿主根的皮层，形成侵入线。随后，皮层细胞进行有丝分裂，继而形成根瘤原基。经过发育，成熟的根瘤即可固氮，当根瘤达到一定数量时寄主会产生信号“Q”，传导到茎，茎部受体接收信号，产生细胞分裂素，传导回根部，终止结瘤[1]。在这个过程中，涉及到寄主植物的多个基因，主要包括调控根瘤原基形成的基因、参与根瘤发育的基因、根瘤自我调控途径基因以及固氮相关的基因。

1 调控根瘤元基形成的基因

经过攻关已初步解析了豆科植物根瘤形成的遗传机制。现已在百脉根、苜蓿、大豆中克隆了NF受体1（NFR1）和受体5（NFR5）基因，为编码跨膜的Lys-M-型丝氨酸/苏氨酸受体激酶。在百脉根中发现一个与NFR5互作的小GTP酶ROP6，其对侵入线形成及结瘤过程均具有正调控作用[2，3]。NFR1和NFR5形成异源二聚体接收NF，启动一系列的下游信号转导级联反应，包括质膜上受体激酶（DMI2、SYM19、NORK）的表达，以及离子通道蛋白（DMI1）等的表达，从而诱导钙峰的产生以及根毛的弯曲变形[4，5]。依赖钙离子蛋白的激酶（DMI3）和GRAS-家族转录因子NSP1和NSP2基因也被克隆，处于NFR和DM2、DM1等基因的下游对胞质 Ca2+浓度变化产生响应[6]。转录因子NIN也在侵染线和根瘤原基中起着重要的作用，它可能与NSP1和NSP2联合在一起，共同调节表皮中结瘤基因的表达和结瘤过程[7]。

除了钙离子通道蛋白参与信号转导外，在百脉根中发现共生信号钾离子通道蛋白基因：2个同源基因Castor和Pollux，它们可以弥补钾离子渗透所产生的电荷不平衡，是细胞核周围钙离子激增所必需的，其中Castor 定位于核膜上[8]。这项成果表明：除了上述根瘤共生体信号通路元件，还存在其他与共生体相关的信号元件。无论结瘤信号怎样传导，最终都会使早期结瘤基因ENOD40表达，进而形成根瘤。ENOD40基因编码含12个氨基酸的多肽A和24个氨基酸的多肽B。多肽A 通过二硫键共价与蔗糖合酶93ku亚基上的一个半胱氨酸结合，多肽B的结合位点尚不清楚。蔗糖合酶是蔗糖代谢的重要组成部分，蔗糖的裂解是植物固氮的关键一步，也是根瘤形成的先决条件[9]。

2 参与根瘤发育的基因

根瘤原基形成后，通过发育可以分别形成无效根瘤和有效根瘤。Rj2控制大豆与根瘤菌USDA7、USDA14和USDA112发育形成无效根瘤。无效结瘤Rj2基因广泛存在于我国东北大豆中，无效结瘤率为64%，导致大豆植株干重及根瘤固氮酶活性下降，并产生缺绿病。显性基因Rj4也控制大豆与根瘤菌USDA33发育形成无效根瘤。目前通过精细定位及原位克隆已获得该基因Glyma.01g165800-D，其编码类甜蛋白。通过CRISPR/Cas9-based基因编辑敲除该基因，有效根瘤数显著增加[10]。通过对大豆基因组分析及根瘤不同发育时期转录组测序，周新安课题组（2016， 2017）获得了调控根瘤发育基因Glyma.15G227500[11]和延迟根瘤衰老的基因Glyma18g12240[12]，均编码半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cystatin）。通过基因过表达分析，转Glyma.15G227500的植株根瘤数增加，转Glyma18g12240的根瘤衰老减慢。

目前已在百脉根中克隆到的调控根瘤发育的基因，包括硫酸盐转运蛋白、锚蛋白重复结构域蛋白、无效结瘤基因、高柠檬酸合成酶、铁转运蛋白、突触融合蛋白、柠檬酸盐转运蛋白、外排蛋白等基因 [13，14]。但基因间的互作及调控机制仍未知。在苜蓿中克隆到的调控根瘤发育基因分别为Kruppel-like 锌指蛋白、HLH类转录因子、ERF类转录因子Mt-EFD、C2H2类转录因子Mt-RSD [15]。其中，Mt-RSD在苜蓿结瘤后6d在根瘤中特异表达，且在的侵染区的表达量最高。苜蓿rsd-1和rsd-2突变体的Mt-RSD基因不能正常表达翻译，导致根瘤原基不能发育为成熟的根瘤。Mt-RSD通过抑制突触小泡膜基因Mt-VAMP721a（Medtr4g022570）的表达，而调控根瘤的发育。

3 根瘤自我调控途径基因

根瘤形成会耗费寄主能量，数目过多将对其生长造成不利的影响。因此，在长期进化中已经发展出1套自主调控机制（Autoregulation of Nodulation，AON）。AON是在根瘤发育过程中通过合成一个衍生于根的信号“Q”来参与从根—茎的长距离信号传递。最近的研究表明，Q可能是一种属于CLAVATA3/ Endosperm-surrounding region （CLE）家族多肽[16]。根瘤达到一定数量时，CLE基因表达，形成小多肽分子，自根向地上运输，并作为富含亮氨酸受体激酶（LRR-RLK）的配体在茎部与LRR-RLK互作并使之激活。目前已知的LRR-RLK家族成员主要有GmNARK、LjHAR1和MtSUNN，与拟南芥CLV1有着极高的序列同源性。激活态的类受体蛋白激酶可能介导合成相应的信号分子，这些信号分子通过韧皮部被运送至根部，调控根部结瘤的数量和发生位置。endprint

Yan等（2013）發现过表达mi R172或预测的靶基因可以相应地增加或减少结瘤的数目和固氮酶的活性，从而证明了 mi R172 在大豆根系结瘤及共生固氮过程中的重要生物学功能[17]。遗传学实验证明了mi R172c正向调控大豆结瘤的早期侵染、根瘤原基发生发育和最终的结瘤数目。Wang等（2014）发现mi R172c 主要是通过剪切其关键的靶基因GmNNC1发挥作用。GmNNC1编码一个AP2 家族的转录抑制子，直接结合在1个重要的早期结瘤基因ENOD40的启动子上，调控其转录活性，实现对结瘤数目的调控。实验结果证明，miR172c 不仅是NF信号通路中的关键调控组分，其表达还受到一个AON信号通路的抑制。mi R172c有可能是整合NF和AON信号通路的关键节点。

4 固氮相关的基因

在固氮开始时和之后，表达的植物基因称为晚期结瘤基因。如豆血红蛋白（Lb）、谷氨酰胺合成酶（GS）等基因与固氮密切相关。研究最多的是豆血红蛋白基因，为固氮过程中固氮酶兼氧所需。现已鉴定出了4个Lb基因，基因结构已解析，但调控机制未知。Lb基因及别的晚期结瘤基因，都只特异的在根瘤中转录，并且多数晚期结瘤基因似乎与豆血红蛋白是协同表达的。GS催化氮素同化反应的第一步，在氮素同化中起着极为关键的作用。根瘤固氮首先是在类菌体中将N2还原为NH4+，在GS的作用下，将植物吸收的无机态氨转变成有机态的谷氨酸和谷氨酰胺，并在一系列酶的作用下形成酰脲向地上运输，因此GS基因是根瘤固氮的关键酶基因之一。目前，仅有GS基因在不同施肥条件下的表达分析，未见其固氮效率调控机制的报道。

除以上两类基因外，共生血红蛋白也与共生固氮有关。共生血红蛋白是血红蛋白的1种，在促进氧扩散的同时又能保持类菌体周围的低氧环境，从而保护对氧敏感的固氮酶活性，缺少豆血红蛋白的根瘤没有固氮活性。

目前，对宿主植物根瘤原基形成的遗传分析（NF信号体系）、根瘤发育基因的克隆、AON途径的解析及固氮相关基因的分离，为共生固氮分子遗传机制的研究打开了一扇大门。但是，大部分基因在共生固氮过程中的具体作用并不完全清楚。而且，目前对参与共生固氮的调控基因仍然知之甚少。无疑包括共生早期信号分子的分离及其功能研究仍将继续是共生领域的研究热点，而随后的共生过程如侵入线形成、根瘤菌的进入与释放、根瘤的发育、共生固氮等现象的探明也非常令人期待，这将为最终建立1个完整明确的共生固氮的分子调控网络提供依据。

参考文献

[1]丑敏霞，魏新元.豆科植物共生结瘤的分子基础和调控研究进展[J].植物生态学报，2010，34（7）：876–888.

[2] Wang Y N，Wang L X，Zou Y M，et al.Soybean miR172c targets the repressive AP2 transcription factor NNC1 to activate ENOD40 expression and regulate nodule initiation[J].The Plant Cell，2014（26）：4782–4801.

[3] Ke D X，Fang Q，Chen C F，et al.The small GTPase ROP6 interacts with NFR5 and is involved in nodule formation in lotus japonicus[J].Plant Physiology，2012（159）： 131-143.

[4] Indrasumunar A，Kereszt A，Searle I，et al.Inactivation of duplicated nod factor receptor 5 （NFR5） genes in recessiveloss-of-function non-nodulation mutants of allotetraploid soybean （Glycine max L.Merr.） [J].Plant Cell Physiology，2010（2）：201-214.

[5] Indrasumunar A，Wilde J，Hayashi S，et al.Functional analysis of duplicated Symbiosis Receptor Kinase （Sym RK） genes during nodulation and mycorrhizal infection in soybean （Glycine max） [J].Plant Physiology，2015，176：157-168

[6] Charpentier M，Vaz M T，Granqvist E，et al.The role of DMI1 in establishing Ca （2+） oscillations in legume symbioses[J].Plant Signal Behavior，2013（8）：e22894.

[7] Oldroyd G E，Murray J D，Poole P S，et al.The rules of engagement in the legume-rhizobial symbiosis[J].Annual Review of Genetics，2011（45）：119-144.

[8] Charpentier M，Bredemeier R，Wanner G，et al.Lotus japonicus CASTOR and POLLUX are ion channels essential for perinuclear calcium spiking in legume root endosymbiosis[J].Plant Cell，2008（20）：3467-3479.endprint

[9] Djordjevic M A，Mohd-Radzman N A，Nijat I.Small- peptidesignals that control root nodule number， development，and symbiosis[J].Journal of Experimental Botany，2015，66（17）：5171–5181.

[10] Tang F，Yang S M，Liu J G，et al.Rj4，a gene controlling nodulation specificity in soybeans，encodes a thaumatin-like protein but not the one previously reported[J].Plant Physiology，2016（170）：26-32.

[11] Yuan S L，Li R，Wang L，et al.Search for nodulation and nodule development-related cystatin genes in the genome of soybean（Glycine max）[J].Frontiers in plant science， 2016（7）：1595.

[12] Yuan S L，Li R，Chen H F，et al.RNA-Seq analysis of nodule development at five different developmental stages of soybean （Glycine max） inoculated with Bradyrhizobium japonicum strain 113-2[J].Scientific Reports，2017（7）：42248.

[13] Hakoyama T，Oi R，Hazuma K，et al.The SNARE protein SYP71 expressed in vascular tissues is involved in symbiotic nitrogen fixation in Lotus japonicus nodules[J].Plant Physiology，2012（160）：897–905.

[14] Takanashi K，Yokosho K，Saeki K，et al.LjMATE1：A citrate transporter responsible for iron supply to the nodule infection zone of Lotus japonicus[J].Plant Cell Physiology，2013（54）：585–594.

[15] Godiard L，Lepage A，Moreau S，et al.MtbHLH1，a bHLH transcription factor involved in medicago truncatula nodule vascular patterning and nodule to plant metabolic exchanges[J].New Physiology，2011（191）：391–404.

[16] Hastwell A H，Gresshoff P M，Ferguson B J，et al.Genome-wide annotation and characterization of CLAVATA/ESR （CLE） peptide hormones of soybean （Glycine max） and common bean （Phaseolus vulgaris），and their orthologues of Arabidopsis thaliana[J].Journal of Experimental Botany，2015，66（17）：5271–5287.

[17] Yan Z，Hossain M S，Wang J，et al.MiR172 regulates soybean nodulation[J].Mol Plant Microbe Interact， 2013（26）：1371-1377.

作者簡介：侯云龙（1982-），男，吉林省公主岭市，助理研究员，大专，主要从事大豆种质资源鉴定与创新研究。endprint