进口大豆中麦角鉴定方法新研究

2017-12-12李林杰李新洲肖忠玉杨洪娟许美玲

大豆科技 2017年5期

关键词：麦角菌核质谱法

李林杰，李新洲，肖忠玉，杨洪娟，王凯，许美玲

（1.日照出入境检验检疫局，山东日照276800；2. 海阳市海洋与渔业局，山东海阳265100）

进口大豆中麦角鉴定方法新研究

李林杰1，李新洲2，肖忠玉1，杨洪娟1，王凯1，许美玲1

（1.日照出入境检验检疫局，山东日照276800；2. 海阳市海洋与渔业局，山东海阳265100）

我国进口大豆逐年迅猛增多，针对进口大豆中麦角和菌核难以鉴定的现状进行分析研究。根据麦角中毒性成分主要是麦角胺、麦角生碱和麦角新碱等成分，比较了食品领域中麦角生物碱不同检测方法的优缺点，选择快速有效的检测方法。根据现状提出3种研究方法：第1种是传统感官生物碱显色法，参考GB 2715-2016《食品安全国家标准粮食》中的检测方法；第2种是液相色谱-质谱/质谱法，结合食品领域中麦角生物碱的检测方法，采用提取、分离、纯化、成分分析等步骤；第3种是分子生物学方法。对麦角菌核酸的制备提取，然后采用普通PCR仪或者荧光定量PCR进行分析检测。研究为病原菌的检验鉴定提供了一种新的思路，采用液相色谱-质谱/质谱法对病原菌产生的致病物质进行分析，丰富了植物病原菌的检验鉴定理论。首次提出对麦角菌利用分子生物学原理进行鉴定，为鉴别进口大豆中的菌核与麦角提供了一个新的标准，为一线人员提供鉴定基础。

菌核；麦角生物碱；液相色谱--质谱//质谱法；麦角菌；分子生物学；PPCCRR

近年来，随着我国人民生活水平的提高，我国大豆进口贸易也得到迅猛发展，进口大豆呈现出持续增长的势头，屡创新高，仅2016年进口大豆8 391万t，预计2017年将超过9 000万t。进口大豆的同时伴随携带昆虫、杂草籽、病害、有害有毒物质、品质不合格等大量问题出现。其中进口大豆中不断检出的黑色鼠粪状的物质，极可能是大豆菌核病菌的菌核或麦角。由于大豆菌核病菌的菌核和麦角在形态上相似，对两者的鉴定一直存在一定的困难，是目前困扰口岸检验检疫人员的一个问题。

进口大豆中检出的黑色鼠粪状的物质以大豆菌核病菌的菌核居多，很多口岸也曾在进口大豆中检出菌核。在实际鉴定过程中，经常从进口大豆中检出小麦、大麦、黑麦草、雀麦等禾本科杂草，所以黑色物质是麦角的可能性也很大，而且很多口岸确实曾从美国、巴西大豆中多次检出麦角菌。人或牲畜若误食了含有麦角的粮食作物，会引发坏疽性麦角中毒和痉挛性麦角中毒[1]。根据GB 2715-2016《食品安全国家标准粮食》和GB 19641-2005《植物油料卫生标准》规定，大豆中不得检出麦角，因此对进口大豆中的黑色鼠粪状的物质进行鉴定具有重大意义。

随着各类学科交叉发展，植物检疫方法不局限于传统的感官检验，分子生物学的应用已经普及，化学分析的方法还待开发利用。常见的有关麦角的鉴定只是停留在2003年制定的标准GB/T5009.36-2003《粮食卫生标准的分析方法》及最新的GB 2715-2016《食品安全国家标准粮食》，对疑似物质进行感官和麦角红素与麦角生物碱定性检测，新的标准只是对这一过程进行了优化。在食品方面的研究领域中[2-3]，对麦角生物碱的研究，主要有以下几个方面：比色分析法（Colorimetry），但此方法只适合总碱含量测定，不能区分麦角生物碱的差向异构体；薄层色谱分析法（Thin layer chromatography，TLC）分析方法简便、快速、成本低，但灵敏度低、重现性差，因此目前多用于定性分析及半定量分析；酶联免疫吸附法（ELISA），具有检测时间短、特异性强、仪器设备和样品前处理简单的特点，适用于大批量样品筛查与现场检测，然而也存在酶标记抗体保存时间有限且用量大，交叉反应，可能出现假阳性和假阴性等弊端；气相色谱法（Gas Chromatography，GC）一般要求被分析物在一定温度下易气化且在气化温度下较稳定。采用GC检测肽型麦角生物碱时，肽型麦角生物碱在进样口温度（250～300℃）下不稳定、易分解，肽型麦角生物碱会发生热分解，产生缩氨酸部分。利用质谱法（Mass spectrometer，MS）可以区分肽型麦角生物碱和其他麦角生物碱，但对于肽型麦角生物碱的差向异构体，如：麦角胺和麦角胺宁，则不能进行区分；高效液相色谱分析法（High performance liquid chromatography，HPLC），该方法具有分析效率高、重现性好、专一性强、灵敏度高等优点，是目前常用的一种麦角生物碱的检测方法，该方法不宜鉴定新化合物、区分特征麦角生物碱及其异构体；仪器联用分析法，气相色谱-质谱法（GC-MS）、电离子质谱法、液相色谱串联质谱法（LC/ESI-MS/MS）等方法，集合了2种方法的优点，提高分析的自动化程度。其中液相色谱串联质谱法（LC/ESI-MS/MS）应用广泛，这种方法能定量分析麦角生物碱的同时确定麦角生物碱的相对分子质量，还可能得到新的化合物。从植物检疫角度介绍3种对疑似物质进行鉴定的实验方法的初步研究，为鉴别菌核与麦角提供思路。

1 GB 2715-2016《食品安全国家标准粮食》

1.1 形态鉴定特征

麦角呈香蕉形或大麦形，有时略扁，长3～10 mm，外面呈黑色或紫黑色，有纵沟与横裂纹，质脆，易折断，断面扁形、钝多边形或椭圆形，中心呈白色、灰白或粉白色，四周呈浅紫色。

1.2 麦角红素和麦角生物碱定性

1.2.1 原理

采用比色法进行麦角红素和麦角生物碱检查。麦角红素在饱和碳酸氢钠溶液中显红色，麦角生物碱的三氯甲烷提取液与对二甲氨基苯甲醛接触后，呈蓝紫色环，数分钟后三氯甲烷层显蓝色，且在365 nm紫外光灯下，其乙醇溶液显蓝色荧光。

1.2.2 步骤

取可疑麦角样品0.5 g，置于研钵中研碎，加2%酒石酸溶液研磨成黏稠状后，加无水乙醚5 mL反复研磨，合并乙醚于试管中。在含乙醚的试管内加0.5 mL饱和碳酸氢钠溶液，振摇，碳酸氢钠溶液层显红色，即表示检出麦角红素。以健康小麦为阴性对照。

在有残渣的研钵中，加氨水（1∶1）研磨呈碱性，用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷层，混匀后分成2份，分别置于2支试管中。取其中1份，沿管壁缓慢加入2 mL对二甲氨基苯甲醛溶液，在两溶液接触面呈蓝紫色环，数分钟后，三氯甲烷层均显蓝色，即表示检出麦角生物碱。

取另一份试管于热水浴上加热，使三氯甲烷挥尽，残留物加无水乙醇溶解，在波长365 nm紫外光灯下观察，显强烈蓝色荧光，即表示检出麦角生物碱。以健康小麦为阴性对照判定。

在麦角鉴定的基础上，麦角红素和麦角生物碱定性检查呈阳性，则可判定在试样中检出麦角[4-6]。

2 液相色谱——质谱/质谱法

2.1 原理

根据麦角的成分比较复杂，其毒性成分主要是麦角胺、麦角生碱和麦角新碱等麦角生物碱。通过测定麦角生物碱的含量，便可以确定该疑似物质为麦角而不是菌核。

2.2 麦角生物碱的提取与分离纯化

提取粉碎样品后，称取4 g于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈-碳酸铵混合溶液（84/16，v/v），振荡提取30 min，在4℃，10 000 r/min，离心10 min，上清液过滤，待纯化。

纯化取4 mL滤液加入试管中，缓慢推入MycoSep®150麦角生物碱多功能净化柱，直至试管底部，量取净化柱管内洗脱液0.5 mL于另一试管中，再加入0.5 mL碳酸铵溶液（3 mmol/L），混合均匀，通过微孔滤膜（0.2 μm）过滤至进样小瓶，待上机分析测定[7-8]。

2.3 测定

2.3.1 液相色谱条件

色谱柱：Gemini-NX 3u C18（100 mm×2.0 mm（i.d.），3 μm）液相色谱柱或相当者。

流动相：A-乙腈，B-碳酸铵溶液（3 mmol/L）。

柱温：30℃。

流速：0.3 mL/min。

进样量：5 μL。

梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相及梯度洗脱条件

2.3.2 质谱条件

电离方式：电喷雾电离（ESI）。

扫描方式：正离子扫描。

电喷雾电压、离子源温度、雾化气、辅助气、气帘气和碰撞气均为高纯氮气，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。

监测方式：多反应监测（MRM）。

2.3.3 定性测定

按照上述仪器条件测定样品和标准液，如果检出的质量色谱峰保留时间与标准样品一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液谱图相比，最大允许相对偏差不超过±30%，则可判断样品中存在对应的被测物。说明此物质含有麦角生物碱，该疑似物为麦角。

3 分子生物学方法

麦角菌属于真菌子囊菌亚门，核菌纲，球壳目，麦角菌科，麦角菌属[9]。

3.1 麦角菌核酸的制备提取

称取经液氮处理的疑似麦角物质粉末0.1 g，移到灭菌的2.0 mL离心管中[10]。加入0.7 mL CTAB提取液。置于水浴锅中65℃水浴30 min，期间不断混匀；

加入5 μL 10 mg/mL RNA酶，充分混匀，在37℃放置30 min；

加入等体积的Tris饱和酚，充分摇匀，在12000r/min下离心15 min；

取上清液，加入等体积三氯甲烷-异戊醇混合液（24/1，v/v），在12 000 r/min下离心15 min（重复2次）；

加入等体积的预冷异丙醇，轻轻摇晃，置于-20℃冰箱静置30min，在12000r/min下离心15min；

弃上清液，加入70%乙醇0.5 mL，在12 000 r/min下离心3 min，去上清液，重复2次。

制得DNA沉淀，用冷冻干燥器进行干燥，加入30～50 μL TE或无菌去离子水，充分溶解后置于-20℃下冰箱中保存（或者应用DNA提取试剂盒法）。

3.2 DNA纯度和浓度的测定

用核酸蛋白分析仪分别在260和280 nm下测定OD值，用于PCR反应的DNA纯度一般为1.6≤OD260/OD280≤2.0。

3.3 麦角菌核酸标准样品的选择

选择麦角菌阳性核酸的标准样品。

3.4 PCR检测

3.4.1 荧光定量PCR检测

（1）选择合适的引物和探针

设计特异性引物和探针，在TaqDNA聚合酶的作用下进行扩增[11]。

（2）PCR扩增条件

95℃变性30 s，95℃变性5 s、60℃退火30 s，共40个循环，最后50℃冷却30 s。

（3）结果判定

通过荧光定量PCR进行阴阳性对照，根据检测Ct值的大小，确定该物质是否为麦角菌的DNA从而确定该物质为麦角。

3.4.2 普通PCR检测

（1）选择通用引物

利用真菌ITS通用引物对ITS4（5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3'）和 ITS5（5'GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3'）进行PCR 扩增[12]。

（2）扩增条件

94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；最后72℃延伸5 min。

（3）扩增步骤

PCR反应可以使用天根产的2*TaqMasterMix试剂盒进行扩增；也可以自配25 μL体系扩增，包括2.5 μL 10 × PCR buffer（Mg2+free），2.0 μL Mg2+（2 mmol/L），2.0 μL dNTP（各200 μmol/L），1 μL上下游引物（10 μmol/L），2 μL模板DNA，1.5 UTaq聚合酶（5 U/μL），加水至25 μL。

以无菌去离子水为空白对照，以提供的阳性对照的DNA为阳性对照，每个样品重复2次。

（4）结果判定

PCR扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，点样5 μL，用1×TAE电泳缓冲液在100 V的电场下电泳30 min左右，EB染色后用凝胶成像系统分析纯化回收条带送公司测序，测序结果经BLAST比对，以确定是否为麦角菌的DNA，从而确定该物质是否为麦角。

4 结论

目前进行麦角鉴定的方法只是先通过传统的感官检验鉴定，发现可疑样品，然后进一步进行麦角红素与麦角生物碱定性检测，该方法需样品量大，过程方法比较复杂，在实际操作中显色现象不明显，况且进口大豆中发现的样品数量本来就少，检疫鉴定困难进一步加大。

研究的目的在于探究进口大豆中麦角快速准确的鉴定方法，一种是利用质谱法对疑似物所含的麦角生物碱衍生物如麦角胺、麦角新碱和麦角克碱等进行测定，来确定疑似物质为麦角；另一种方法是分子生物学方法，提取核酸，利用PCR检测，来确定是否为麦角菌。研究为病原菌的检验鉴定提供了一种新的思路，改变过去增菌、分离、鉴定的传统模式，采用了质谱法对病原菌产生的致病物质进行分析，丰富了植物病原菌的检验鉴定理论。研究首次提出对麦角菌利用分子生物学原理进行鉴定，为麦角和菌核的区别鉴定提供了一个新的标准，为一线人员提供了鉴定基础。

[1] WallweyC,LiShuming.Ergotalkaloids:structurediversity,biosynthetic gene clusters and functional proof of biosynthetic genes[J].Natural Product Reports,2011,28(3):496-510.

[2] 卢春霞,王洪新.麦角生物碱的研究进展[J].食品科学,2010(11):282-288．

[3] 王垠辉,张峥,马红梅,等.农产品中麦角生物碱分析方法的研究进展[J].食品科学,2012,33(19):353-357．

[4] 刘跃庭,罗加凤,牛春敬,等.进口大豆中菌核和麦角的鉴别[J].植物检疫,2013,27(1):30-33.

[5] 国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.GB 2715-2016《食品安全国家标准粮食》[S].北京:中国标准出版社,2017.

[6] 邵秀玲,厉艳,魏晓棠,等.浅析进口小麦中截获的有害生物—麦角[J].植物检疫,2006,20(3):150-151．

[7] 曾丽娟,李琦,刘志国,等.麦角碱的提取与分离纯化[J].武汉工业学院学报,2010,29(3):2386-2095.

[8] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 4524-2016出口粮谷中6种麦角生物碱的测定液相色谱-质谱/质谱法[S].北京:中国标准出版社,2017.

[9] 中华人民共和国珠海出入境检验检疫局.SN/T 2965-2011植物病原真菌分子生物学检测规范[S].北京:中国标准出版社,2011.

[10]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 3399-2012大豆茎溃疡病菌检疫鉴定方法--TaqMan MGB探针实时荧光PCR检测方法[S].北京:中国标准出版社,2013.

[11]胡晨曦,杨金玲,程克棣,等.麦角碱生物合成途径中酶学及相关基因研究进展[J].西北植物学报,2005,25(4):819-828．

[12]雷娅红,况卫刚,郑春生,等.进境草种种带真菌的检测与初步鉴定[J].草业科学,2016,33(1):46-53.

A New Identification Method for Ergot of Imported Soybean

Li Linjie1,Li Xinzhou2,Xiao Zhongyu1,Yang Hongjuan1,Wang Kai1,Xu Meiling1
(1.Rizhao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Rizhao 276800,Shandong，China;2.Haiyang Municipal Ocean and Fisheries Administration,Haiyang 265100,Shandong，China)

The import of soybean in China is increasing year by year,and it is difficult to identify the ergot and sclerotium in the imported soybean.According to the toxic components of ergot,the main components are ergotamine,ergot alkaloids,ergometrine and other ingredients.Comparing the advantages and disadvantages of ergot alkaloids in the field of food detection methods,fast and effective detection methods were chosen.According to the present situation,three kinds of methods were proposed:one was the traditional sense of alkaloid color method,referenced GB 2715-2016quot;national food safety standards of foodquot;;the second detection method was liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,combined with detection method in the field of food of ergot alkaloids detection method,by using the steps of extraction,purification,composition analysis and other steps;the third was the method of molecular biology.The preparation and extraction of ergot nucleic acid were carried out,and then analyzed by common PCR instrument or fluorescent quantitative PCR.This study provided a new method for the detection and identification of pathogenic bacteria,and analyzed the pathogenic substances produced by pathogenic bacteria by liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry,which enriched the theory of plant pathogen testing and identification.The molecular biology principle of ergot fungus was identified for the first time,which provided a new standard for identification of sclerotia and ergot in imported soybeans,providing an identification base for front-line personnel.

Sclerotium;Ergot alkaloid;Liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry;Ergot;Molecular biology;PCR

S565.1

1674-3547(2017)05-0029-05