载辛伐他汀/纳米羟基磷灰石胶原复合组织工程材料对大鼠牙槽骨缺损的修复作用

许莹莹，王敬，韩尚志，张兴乐，王鹏，时静华,李石岩

(1承德医学院附属医院，河北承德067000；2 承德市中心医院)

载辛伐他汀/纳米羟基磷灰石胶原复合组织工程材料对大鼠牙槽骨缺损的修复作用

许莹莹1，王敬1，韩尚志1，张兴乐1，王鹏1，时静华1,李石岩2

(1承德医学院附属医院，河北承德067000；2 承德市中心医院)

目的观察载辛伐他汀/纳米羟基磷灰石胶原(NHAC)复合组织工程材料对大鼠牙槽骨缺损的修复作用。方法将45只大鼠随机分为载辛伐他汀/NHAC组、NHAC组、空白组各15只，均于下颌右侧制备骨缺损区，分别植入载辛伐他汀/NHAC材料、植入NHAC材料、不植入材料，于术后2、4、8周分别取5只大鼠观察大体情况，使用钼靶摄影机检测切牙拔牙窝的骨密度，HE染色观察颌骨组织病理学表现，显微镜下观察植骨区域骨小梁形成情况，计算新骨形成面积占视野总面积的百分比。结果3组术后均无骨折发生，伤口无感染、坏死，创口愈合良好、无开裂，黏膜平整，色泽正常。3组术后2、4、8周下颌骨缺损区骨密度均随时间延长逐渐升高(P均<0.05)；载辛伐他汀/NHAC组术后2、4、8周下颌骨缺损区骨密度均高于NHAC组、空白组(P均<0.05)。载辛伐他汀/NHAC组术后2周拔牙窝骨壁邻近区域即有少量新骨形成，4周时新生骨增加并有骨岛形成，8周时新生骨沉积线明显，骨小梁致密，数量多；NHAC组术后2周可见较稀疏的编织骨，周围可见成骨细胞，4周时可见较密集新生骨，8周时可见新生骨沉积线；空白组术后2周有少量新骨形成伴有炎性细胞浸润，4周时形成的新骨较少且分散，伴有炎性细胞浸润，8周时有较多骨小梁形成，牙槽窝内骨小梁较稀疏。3组术后2、4、8周新生成骨面积百分比随时间延长逐渐升高(P均<0.05)；载辛伐他汀/NHAC组术后2、4、8周新生成骨面积百分比均高于NHAC组、空白组(P均<0.05)。结论载辛伐他汀/NHAC复合组织工程材料可以促进牙槽骨缺损的修复，增加骨密度，促进新骨形成。

辛伐他汀；纳米羟基磷灰石；复合组织工程材料；牙槽骨；骨缺损；骨修复;大鼠

牙槽骨缺损主要由肿瘤、外伤、先天发育畸形、牙周病等原因造成，不仅影响患者的语言、牙齿咬合功能，也影响正畸牙齿的移动[1，2]。近年来，引导骨再生技术在骨缺损的修复中得到广泛应用。该技术是利用生物材料制成的生物膜，在牙龈软组织与骨缺损之间人为地竖起一道生物膜屏障，阻止软组织中成纤维细胞及上皮细胞长入骨缺损区，确保成骨过程在无上皮及成纤维细胞等优势生长细胞干扰的前提下逐渐完成，最后实现缺损区完全的骨修复[3，4]。纳米羟基磷灰石胶原(NHAC)是利用纳米技术在纳米结构单元或纳米数量级下生产的新型仿生骨材料，具有优越的生物相容性和生物活性，无细胞毒性，能促进和加快骨的愈合。另有研究[5,6]显示，载辛伐他汀支架材料不仅能够提高辛伐他汀的生物利用度，还可以降低其不良反应。2016年5～12月，我们观察了载辛伐他汀/NHAC复合组织工程材料对大鼠牙槽骨缺损的修复作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级Wistar雄性大鼠45只，体质量(200±20)g，购于山东鲁抗医药股份有限公司。于室温20～25 ℃、湿度50%～60%条件下适应性饲养1周，自由进食、饮水。NHAC复合材料由清华大学材料科学与工程学系研发，北京奥精生物医药科技有限公司提供。载辛伐他汀/NHAC复合组织工程材料的合成：将辛伐他汀与NHAC按照一定比例混合均匀，搅拌后再进行交联处理，最后冷冻干燥得到支架材料。

1.2 动物分组与模型制备 将大鼠按随机数字表法分为载辛伐他汀/NHAC组、NHAC组、空白组，每组15只。采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，于下颌右侧制备缺损区。局部注射2%利多卡因加0.1%盐酸肾上腺素，完整拔除右下颌中切牙，慢速柱形裂钻配合生理盐水冲洗降温。在拔牙窝基础上颊舌向、近远中向扩展牙槽窝，制备箱型缺损区域。修整平齐缺损区域上缘，消除尖锐骨嵴。骨缺损区制备完毕后，载辛伐他汀/NHAC组植入载辛伐他汀/NHAC材料，NHAC组植入NHAC材料，空白组不植入材料。3组均行褥式缝合加固骨膜，间断缝合牙龈，创口缝合严密、平整、骨膜无外露，生理盐水局部冲洗。术后7 d肌注青霉素40万U/d预防感染。

1.3 标本采集及处理 于术后2、4、8周3组分别随机取5只大鼠，采用10%水合氯醛0.5 g/kg腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛心脏灌注进行固定。固定完全后，分离下颌骨，置于4%多聚甲醛内加强固定24 h。

1.4 观察指标

1.4.1 大体情况 观察术区表面牙龈上皮愈合情况，检查是否存在骨折、感染、坏死、瘘道等；切开软组织，观察植骨区表面愈合情况。

1.4.2 下颌骨缺损区骨密度 采用MAMMOMAT3000型钼靶摄影机对下颌骨标本进行摄影，设置参数为电压29 kV、曝光量8～11 mA。扫描图像，采用专业图像分析软件Image Pro Plus v6对大鼠下颌骨缺损区的灰度值进行分析，以灰度值表示骨密度。

1.4.3 下颌骨组织形态 将下颌骨标本放入10% EDTA溶液中脱钙，垂直于下颌骨长轴，切取从下颌第一磨牙近中邻面至其远中3 mm处的、连同部分下颌第一磨牙的颌骨组织块，常规脱水、浸蜡、包埋、切5 μm厚切片，HE染色，光镜下观察。

1.4.4 新生成骨面积百分比 取下颌骨组织标本切片，低倍镜下观察缺损区新骨形成情况；计算机采集图像，通过软件测定新骨形成面积占视野总面积的百分比。

2 结果

2.1 各组大体情况 术后各组大鼠均无骨折发生，伤口无感染、坏死，创口愈合良好、无开裂。黏膜平整，色泽正常。

2.2 各组下颌骨缺损区骨密度比较 术后2、4、8周，载辛伐他汀/NHAC组下颌骨缺损区骨密度均高于NHAC组和空白组，NHAC组高于空白组(P均<0.05)。组内不同时间点比较，NHAC组和空白组术后8周时的下颌骨缺损区骨密度均高于术后2、4周时，术后4周时高于术后2周时(P均<0.05)；载辛伐他汀/NHAC组2、4、8周时下颌骨缺损区骨密度比较无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组术后不同时间点下颌骨缺损区骨密度比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与NHAC组比较，#P<0.05；与术后2周比较，▲P<0.05；与术后4周比较，△P<0.05。

2.3 各组下颌骨组织形态学比较 术后2周，载辛伐他汀/NHAC组拔牙窝骨壁邻近区域有少量新骨形成；NHAC组可见较稀疏的编织骨，周围可见成骨细胞；空白组有少量新骨形成伴有炎性细胞浸润。术后4周，载辛伐他汀/NHAC组牙槽窝内可见新生骨增加，并有骨岛形成；NHAC组牙槽窝内可见较密集新生骨；空白组形成的新骨较少且分散，仅限于牙槽窝骨壁附近，伴有炎性细胞浸润。术后8周，载辛伐他汀/NHAC组较NHAC组新生骨沉积线明显，骨小梁致密，数量多；空白组牙槽窝周边有较多骨小梁形成，牙槽窝内骨小梁较稀疏。

2.4 各组新生成骨面积百分比比较 术后2、4、8周，载辛伐他汀/NHAC组新生成骨面积百分比均高于NHAC组和空白组，NHAC组高于空白组(P均<0.05)。组内不同时间点比较，载辛伐他汀/NHAC组和NHAC组术后8周时的新生成骨面积百分比均高于术后2、4周，术后4周高于术后2周(P均<0.05)；空白组新生成骨面积百分比术后2、4、8周比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组不同时间新生成骨面积百分比比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与NHAC组比较，#P<0.05；与术后2周比较，▲P<0.05；与术后4周比较，△P<0.05。

3 讨论

牙齿拔除后，牙槽嵴可发生持续性、进行性、不可逆性的骨吸收，常造成牙槽嵴低平或呈刃状，给义齿修复或种植体植入造成困难[7，8]，影响机体的咀嚼功能。骨组织工程在治疗骨缺损方面具有显著优势，支架材料作为骨组织工程的重要组成部分，其相关研究越来越多[11，12]。人工支架材料具有优良的生物相容性、骨引导性和生物可降解性，易于塑形及临床操作。辛伐他汀具有促进骨形成、增加骨强度、刺激成骨细胞分化、加快骨重建时间等作用，通过扩散、渗透方式，到达牙槽骨骨组织缺损区域，具有较弱的缓释效应，可较快地发挥药效，增加牙槽窝内骨密度，刺激成骨细胞分化，促进新骨形成，修复牙槽骨骨组织缺损。但口服辛伐他汀在骨组织的利用率远远达不到骨形成部位所需要的剂量，而局部大量注射辛伐他汀又具有细胞毒性[13，14]，且由于他汀类药物扩散快，半衰期短，需要反复注射才能获得理想药效，患者难以接受。因此，优化辛伐他汀的给药途径对提高其促进骨形成效果、减少不良反应至关重要。NHAC是以纳米晶胶原基骨为材料，由于羟基磷灰石的晶体结构、成分与人骨无机矿物成分基本相同，因此具有良好的生物相容性；而多孔的羟基磷灰石因其孔隙可增加成骨细胞、生长因子黏附、增殖的表面积，更利于纤维血管再生，因此具有更好的生物活性；纳米级的羟基磷灰石表面积更大，可黏附更多的细胞；同时具有表面效应及体积效应，在力学和生物学方面有很大的优越性和应用潜力。载辛伐他汀/NHAC结合两者的优势，经扩散和渗透等环节释放出来辛伐他汀，这个释放程度持续，且始终接近匀速，促进成骨的效果更加明显，通过持续、有效地释放，为新骨的形成提供诱导因子，又能为新骨生长提供支架，兼具骨传导和骨诱导的双重作用，牙槽窝的骨密度逐渐提高，新生的骨小梁逐渐增多、增宽。

骨密度全称是骨骼矿物质密度，是骨骼强度的一个重要指标。拔牙窝的愈合过程主要表现为血凝块的机化，成骨细胞分化、成熟，骨基质的分泌、矿化，类似于骨组织缺损的修复过程[15，16]。因此，检测骨密度能反映骨的愈合程度。本研究结果显示，3组术后2、4、8周拔牙窝骨密度组间比较差异均有统计学意义，载辛伐他汀/NHAC组术后2、4、8周拔牙窝骨密度均高于NHAC组和空白组，表明载辛伐他汀/NHAC更有利于骨组织缺损的修复。

研究表明，拔牙窝组织的病理学特征变化的趋势与骨密度改变的情况相对应。本研究结果显示，各组下颌切牙拔牙窝内新生骨小梁的大小、密度随时间延长逐渐增加，载辛伐他汀/NHAC组的组织学情况最佳，提示载辛伐他汀/NHAC修复骨组织缺损的效果最佳。新生成骨面积百分比是新骨形成的指标，能直接反映骨的修复情况。本研究结果显示，载辛伐他汀/NHAC组术后2、4、8周新生成骨面积百分比均高于NHAC组和空白组，表明载辛伐他汀/NHAC与NHAC比较，更能促进新骨的形成。

综上所述，载辛伐他汀/NHAC复合组织工程材料容易制备，操作简便，能够通过稳定地释放药物为新骨的形成提供诱导因子，又能为新骨生长提供支架，促进新骨形成，从而促进牙槽骨缺损的修复。

[1] 苏寒,张森林,董震.组织工程化引导骨再生膜的构建及其修复牙槽骨缺损的实验研究[J].医学研究生学报,2013,26(9):932-936.

[2] 庞永志,胡温庭,彭凤梅.复方白芨胶/珍珠层粉修复兔牙槽骨缺损的实验研究[J].山东大学学报(医学版),2013,51(1):37-41.

[3] 丁建勇,魏琳,郭家平.不同类型骨移植材料修复牙周牙槽骨缺损[J].中国组织工程研究,2012,16(16):3033-3036.

[4] 张琴,杨川博,何惠宇,等.组织工程化骨修复羊牙槽骨缺损[J].中国组织工程研究,2013,17(34):6089-6096.

[5] 王慧,罗晓晋,武锋.辛伐他汀与Bio-Oss骨粉混合物对种植体周围缺损骨重建中破骨细胞的作用[J]. 中国药物与临床,2013,13(4):434-436.

[6] 刘志,关键,段峰,等.载辛伐他汀纳米羟基磷灰石支架材料对兔下颌骨缺损修复的影响[J].口腔颌面外科杂志,2013,23(1):14-17.

[7] Srivastava R, Verma PK, Tripathi V, et al. Management of oehlers type Ⅱ dens in dente with open apex and alveolar bone defect[J]. J Clin Diagn Res, 2016,10(11):ZJ05-ZJ06.

[8] Shyu SS, Fu E, Shen EC. Clinical and microcomputed topography evaluation of the concentrated growth factors as a sole material in a cystic bony defect in alveolar bone followed by dental implantation: a case report[J]. Implant Dent, 2016,25(5):707-714.

[10] 刘敏,周力,王艳民.正畸相关牙槽骨缺损现象的研究现状[J].国际口腔医学杂志,2013,40(4):500-502.

[11] 张国锋,庞永志.骨移植材料在局部牙槽骨缺损中的应用进展[J].中国现代医药杂志,2013,15(3):117-120.

[12] 朱建华,马珊珊,李慕勤,等.新型骨支架复合材料修复牙槽骨缺损研究[J].口腔医学研究,2012,28(8):767-771.

[13] Holmström EJ, Lemström KB, Tuuminen R. Simvastatin treatment upregulates anti-Fibrotic bone morphogenetic protein-7 expression at rat cardiac allograft rejection[J]. Pharmacology, 2016,98(5-6):204-208.

[14] Issa JP, Ingraci de Lucia C, Dos Santos Kotake BG, et al. The effect of simvastatin treatment on bone repair of femoral fracture in animal model[J]. Growth Factors, 2015,33(2):139-148.

[15] Moshiri A, Shahrezaee M, Shekarchi B, et al. Three-dimensional porous gelapin-simvastatin scaffolds promoted bone defect healing in rabbits[J]. Calcif Tissue Int, 2015,96(6):552-564.

[16] Rivera C, Monsalve F, Salas J, et al. Platelet-rich plasma, plasma rich in growth factors and simvastatin in the regeneration and repair of alveolar bone[J]. Exp Ther Med, 2013,6(6):1543-1549.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.42.012

R782

A

1002-266X(2017)42-0043-03

河北省承德市科技计划支撑项目(201601A025)。

2017-02-20)