原代人黑素细胞Wnt5A基因沉默的研究

粟倩雅 林彤 张孟丽 彭霖

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病医院激光科（第一作者现在东南大学附属中大医院皮肤科，210009南京）

·论著·

原代人黑素细胞Wnt5A基因沉默的研究

粟倩雅 林彤 张孟丽 彭霖

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病医院激光科（第一作者现在东南大学附属中大医院皮肤科，210009南京）

目的 优化Wnt5A特异性siRNA转染原代人黑素细胞的实验条件，建立沉默Wnt5A基因的模型。方法 培养原代人黑素细胞，将不同浓度（0、20.0、33.3、40.0、60.0 nmol/L）的阳性参照基因GAPDH特异性siRNA通过脂质体法介导转染原代人黑素细胞，实时荧光定量PCR（qPCR）筛选转染效率最高的siRNA浓度；合成3条Wnt5A-siRNA（Wnt5A-siRNA-793、Wnt5A-siRNA-943、Wnt5A-siRNA-1743），分别转染原代人表皮黑素细胞，qPCR法选择干扰特异性最佳的Wnt5A-siRNA；用最佳Wnt5A-siRNA转染原代人黑素细胞，分别于培养24、48、72 h提取总mRNA及总蛋白，通过qPCR及Western印迹法确定转染效率最高的时间点。结果 0、20.0、33.3、40.0、60.0 nmol/L GAPDH-siRNA转染原代人黑素细胞后，GAPDH mRNA相对表达量分别为1.009±0.161、0.086±0.010、0.140±0.016、0.285±0.095、0.012±0.007，组间比较，差异有统计学意义（F=69.469，P ＜ 0.05）。60 nmol/L siRNA组GAPDH表达低于其他各组（均P＜0.05），干扰效率最佳；各Wnt5A-siRNA组及空白组Wnt5A mRNA相对表达量分别为0.331±0.010、2.229±0.029、0.078±0.006、1.000±0.024，差异有统计学意义（F=7 006.094，P＜0.05）。Wnt5A-siRNA-1743组目标分子表达量低于其他3组（均P＜0.05），干扰效率最佳。Wnt5A-siRNA-1743转染原代人表皮黑素细胞后24、48、72 h及空白组Wnt5A mRNA相对表达量分别为0.396±0.002、0.026±0.008、0.131±0.079、1.025±0.276，组间比较，差异有统计学意义（F=29.215，P ＜0.05），干扰后48 h低于干扰后24、72 h及空白组（均P ＜0.05）；Wnt5A蛋白相对表达量分别为112.798±0.218、77.765±0.415、30.540±0.219、130.025±0.158，组间比较，差异有统计学意义（F=79 122.889，P＜0.05），干扰后72 h低于干扰后24、48 h及空白组（均P＜0.05）。结论 成功建立siRNA沉默人黑素细胞Wnt5A基因的模型。

黑素细胞；RNA，小分子干扰；基因沉默；Wnt5A

用于介导小干扰RNA（siRNA）转染人细胞的方法有病毒介导法、脂质体法、电穿孔法、磷酸钙法和显微注射法［1］等。脂质体具有和细胞膜或细胞器膜相似的结构，与细胞相容性较高，所以脂质体法是比较有前景的方法［2］。但在脂质体介导的转染中，其转染效率会因质粒和脂质体比例、细胞密度等的不同而有所差异，且脂质体试剂还会对细胞产生一定毒性，引起细胞死亡，从而不易区分靶基因表达水平的降低是干扰作用还是细胞死亡的缘故。因此，有必要对转染条件进行优化，从而获得理想的转染效果。本研究旨在用Wnt5A特异性siRNA转染原代人黑素细胞，沉默Wnt5A基因，确定转染效率最高的实验方法，建立基因特异性基因沉默模型，为黑素细胞的基因功能、分子通路等研究提供参考。

材料与方法

一、主要试剂与仪器

Medium254黑素细胞培养基、HMGS添加剂、分离酶（Protease type IX）、Opti-MEM培养基、完全1640培养基（美国Gibco公司）。cDNA合成试剂盒，脂质体试剂Lipofectamine®3000（美国Thermo公司），BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），实时荧光定量PCR（qPCR）试剂盒（美国Vazyme公司）。

二、方法

1.原代人黑素细胞的分离与培养：取男童包皮环切术后多余皮肤，聚维酮碘、磷酸盐缓冲液冲洗。将皮肤组织剪成细长条，放入2.5 g/L分散酶中4℃消化14～16 h。分离表皮与真皮，剪碎表皮，加入0.25%胰酶，0.01%乙二胺四乙酸（EDTA）室温下消化2～3 min，离心、弃上清液；用完全黑素培养基混悬沉淀物，接种于培养瓶中。24 h后换液去除未贴壁的细胞，以后每2～3天换液1次。15～20 d后培养细胞达到70%～80%融合时，传代纯化培养。取第2～5代细胞用于实验。本研究经中国医学科学院皮肤病医院医学伦理委员会批准，患儿监护人均签署知情同意书。

2.不同浓度阳性参照GAPDH特异性siRNA转染原代人黑素细胞：将细胞种到6孔板上，待细胞融合60%～70%时，各孔加入2 ml M254黑素细胞培养基。转染体系如下：脂质体试剂（Lipo）管加入Opti-MEM 117.5 μl、Lipo3000 7.5 μl，静置 5 min；siRNA管加入Opti-MEM、GAPDH-siRNA（序列为5′-UGAC CUCAACUACAUGGUUTTAACCAUGUAGUUGAGG UCATT-3′）。第1～5组GAPDH-siRNA浓度分别设定为0（对照组）、20、33.3、40、60 nmol/L，所加入的GAPDH-siRNA分别为0、2.25、3.75、4.5、6.75 μl，以Opti-MEM培养基稀释至总容积125 μl，其中第3组为Lipo3000说明书推荐浓度。将siRNA加入脂质体试剂中，室温孵育10～15 min。最后将RNA-Lipo混合物加入对应各细胞孔中。培养48 h提总mRNA，反转录为cDNA，行qPCR：50℃ 2 min；95℃预变性10 min；95℃变性10 s；60℃退火/延伸40 s；共40个循环后采集荧光信号；60℃～95℃缓慢升温进行熔解曲线分析。参照说明书通过相对CT法检测GAPDH的基因表达，计算各组GAPDH干扰效率。

3.Wnt5A特异性siRNA转染原代人黑素细胞：将细胞种到6孔板上，待细胞融合60%～70%时，各孔加入2 ml M254黑素细胞培养基。转染体系如下：Lipo管加入Opti-MEM 117.5 μl、Lipo3000 7.5 μl，静置5 min；siRNA管加入Opti-MEM 118.25 μl、Wnt5A-siRNA 6.75 μl，混匀。Wnt5A-siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成，分别是Wnt5A-siRNA-793（序列5′-GUGGUCGCUAGGUAUGAAUTTAUUCAUACC UAGCGACCACTT-3′）、Wnt5A-siRNA-943（序列 5′-CGCGAAGACAGGCAUCAAATTUUUGAUGCCUGU CUUCGCGTT-3′）、Wnt5A-siRNA-1743（序列 5′-GCUACGUCAAGUGCAAGAATTUUCUUGCACUUG ACGUAGCTT-3′）。将siRNA管加入脂质体试剂管中，室温孵育10～15 min。最后将RNA-Lipo混合物加入对应各细胞孔中，培养48 h提取总mRNA，反转录得cDNA，行qPCR：50℃ 2 min；95℃ 预变性10 min；95 ℃变性10 s；60℃退火/延伸40 s；共40个循环后，采集荧光信号；60℃～95℃缓慢升温进行熔解曲线分析。参照说明书通过相对CT法检测Wnt5A基因表达，计算各组Wnt5A干扰效率。Wnt5A扩增引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，正向引物为5′-CCTTCGCCCAGGTTGTAAT-3′，反向引物为5′-AGAGAGGCTGTGCTCCTATAA-3′。

4.培养时间对转染效率的影响：选取实验方法3中干扰特异性最佳的Wnt5A-siRNA转染黑素细胞，转染、培养过程如方法3。分别培养24、48、72 h，提取mRNA及总蛋白，反转录成cDNA，并通过qPCR及Western印迹法，计算转染效率。ImageJ软件对所得条带进行灰度分析，计算目的条带与内参条带GAPDH相对灰度的比值，分析各时间点Wnt5A干扰效率。

三、统计学方法

结 果

一、GAPDH特异性siRNA转染原代人黑素细胞

各浓度 GAPDH-siRNA 组（0、20、33.3、40、60 nmol/L）GAPDH mRNA相对表达量分别为1.009±0.161、0.086 ± 0.010、0.140 ± 0.016、0.285 ± 0.095、0.012±0.007，组间比较，差异有统计学意义（F=69.469，P ＜0.05），60 nmol/L siRNA组GAPDH表达低于其他各组（q值分别为 20.517、1.523、2.635、5.606，均P ＜ 0.05），干扰效率最佳。

二、Wnt5A特异性siRNA转染原代人黑素细胞

Wnt5A-siRNA转染原代人表皮黑素细胞后，Wnt5A-siRNA-793组、Wnt5A-siRNA-943组、Wnt5A-siRNA-1743组及空白组的Wnt5A mRNA相对表达量分别为 0.331±0.010、2.229±0.029、0.078±0.006、1.000±0.024，组间比较，差异有统计学意义（F=7 006.094，P ＜ 0.05），Wnt5A-siRNA-1743组目标分子表达量低于其他3组（q值分别为80.816、22.139、188.532，均P ＜ 0.05），干扰效率最佳。

三、培养时间对转染效率的影响

Wnt5A-siRNA-1743转染细胞后24、48、72 h及空白组Wnt5A mRNA表达量分别为0.396±0.002、0.026±0.008、0.131±0.079、1.025±0.276，组间比较，差异有统计学意义（F=29.215，P ＜0.05），干扰后48 h低于干扰后24 h、干扰后72 h及空白组（q值分别为12.042、4.453、1.261，均P ＜ 0.05）。干扰后24、48、72 h及空白组Wnt5A蛋白表达量分别为112.798 ± 0.218、77.765 ± 0.415、30.540 ± 0.219、130.025±0.158，组间比较，差异有统计学意义（F=79 122.889，P ＜ 0.05），干扰后24、48、72 h蛋白表达率分别为对照组的86.75%、59.81%、23.49%，干扰效率分别为13.25%、40.19%、76.51%，干扰后72 h低于干扰后24 h、干扰后48 h及空白组（q值分别为637.114、526.792、302.305，均P ＜ 0.05）。培养48 h后对Wnt5A mRNA、72 h后对Wnt5A蛋白干扰效率最高。见图1。

图1 Wnt5A-siRNA转染原代人黑素细胞后不同时间点Wnt5A蛋白与阳性参照GAPDH蛋白的表达量

讨 论

为使Wnt5A在原代人黑素细胞内表达降低，多种转染媒介如慢病毒、腺病毒、shRNA、siRNA［3］等均可使用。病毒载体可实现高效稳定转染，但价格昂贵；siRNA较shRNA转染效率相似，有效时间略短但成本更低，因此选择siRNA进行实验。由于siRNA作用方式为瞬时转染，有效时间在72～96 h内，因此需要确定siRNA转染后对mRNA和蛋白干扰效率最佳的时间。预实验证实，干扰效率最佳的时间在基因水平为48 h，蛋白水平为72 h。理论上可通过对目标mRNA的分析，准确找到siRNA的最佳作用位置，但这个过程十分耗时且昂贵。可行的解决方案是对目标序列设计3～4对siRNA，筛选出转染效率最高的一段siRNA进行后续的实验。由于siRNA直接作用于mRNA，检测mRNA水平是最直接的指标，因此在预实验中我们主要选择qPCR验证转染效率。

由于相关文献［4-5］支持较少，siRNA成功转染原代人黑素细胞是本实验的难点。我们在早期尝试用Lipofectamine3000试剂盒推荐的体系来转染3条siRNA，均未成功。于是选用阳性参照GAPDH特异性siRNA来摸索适合于原代人黑素细胞的转染体系，选出干扰效率最高的浓度转染后续目标基因siRNA。GAPDH是实验常用的管家基因，作为阳性参照时特异性高，一旦转染成功即可使GAPDH基因沉默。有文献［6］报道脂质体试剂会对细胞产生一定毒性，本实验所用的转染试剂Lipofectamine3000是新一代转染试剂，实验剂量更小、时间更短，我们于转染后6、24、48、72 h观察细胞，细胞状态均良好，未发现有明显的细胞死亡，Lipofectamine3000对原代人黑素细胞的毒性可能不会对转染效果产生影响。由于siRNA作用时间短，不适用于转染需要传代的细胞，本实验没有对干扰后的细胞进行冻存和复苏。

在实验过程中发现，siRNA的干扰效率除了与所用siRNA浓度、序列有关，与细胞传代数也相关。细胞传代数较高时，转染不易成功，建议选择2～4代原代人黑素细胞进行转染实验。由于转染后没有明显细胞死亡，细胞仍需生长2～3 d才行后续实验，因此在细胞融合60%～70%时即可进行转染；Lipofectamine3000介导的转染一般在6 h内完成，细胞量过少可能造成分裂后细胞增多，转染效率下降，而细胞过密又可造成细胞凋亡，因此选择合适的时机进行转染实验也非常重要。在本实验中，我们成功建立了siRNA转染原代黑素细胞模型，可作为其他如黑素细胞的基因功能、分子通路等研究的参考。

［1］Pathak A,Patnaik S,Gupta KC.Recent trends in non-viral vectormediated gene delivery［J］.Biotechnol J,2009,4（11）:1559-1572.DOI:10.1002/biot.200900161.

［2］Zhang S,Zhi D,Huang L.Lipid-based vectors for siRNA delivery［J］.J Drug Target,2012,20（9）:724-735.DOI:10.3109/1061186X.2012.719232.

［3］Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells［J］.Nature,2001,411（6836）:494-498.DOI:10.1038/35078107.

［4］Ganesan AK,Ho H,Bodemann B,et al.Genome-wide siRNA-based functional genomics of pigmentation identifies novel genes and pathways that impact melanogenesis in human cells［J］.PLoS Genet,2008,4（12）:e1000298.DOI:10.1371/journal.pgen.1000298.

［5］Van Gele M,Geusens B,Schmitt AM,et al.Knockdown of myosin Va isoforms by RNAi as a tool to block melanosome transport in primary human melanocytes［J］.J Invest Dermatol,2008,128（10）:2474-2484.DOI:10.1038/jid.2008.100.

［6］李吉,刘作金.不同试剂转染RIP140-siRNA至库普弗细胞的效率及毒性比较［J］.南方医科大学学报,2015,（12）:1694-1700.DOI:10.3969/j.issn.1673-4254.2015.12.06.

Wnt5A gene silencing in primary human melanocytes

Su Qianya,Lin Tong,Zhang Mengli,Peng Lin Laser Department,Hospital of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（the current affiliation of the first author was Department of Dermatology,Zhongda Hospital Southeast University,Nanjing 210009,China）

Lin Tong,Email:ddlin@hotmail.com

Objective To optimize experimental conditions for transfecting primary human melanocytes with Wnt5A-specific siRNA,and to establish the Wnt5A gene silencing model.Methods Primary human melanocytes（PHM）were cultured in vitro.Positive control GAPDH-siRNAs at different concentrations of 0,20.0,33.3,40.0 and 60.0 nmol/L were transfected into PHM by using liposomes.Realtime fluorescence-based quantitative PCR（qPCR）was performed to select the optimal concentration of siRNA with the highest transfection efficiency.Three Wnt5A-siRNAs including Wnt5A-siRNA-793,Wnt5A-siRNA-943 and Wnt5A-siRNA-1743 were constructed and transfected into PHM separately,and qPCR was conducted to select the most specific Wnt5A-siRNA.Then,the most specific Wnt5A-siRNA was transfected into PHM,and the total mRNA and total protein were extracted after 24-,48-and 72-hour treatment.qPCR and Western blot analysis were performed to determine the optimal time with the highest transfection efficiency.Results There were significant differences in the mRNA expression of GAPDH among cells transfected with GAPDH-siRNAs at different concentrations of 0,20.0,33.3,40.0 and 60.0 nmol/L（1.009±0.161,0.086±0.010,0.140±0.016,0.285±0.095,0.012±0.007 respectively;F=69.469,P＜0.05）.Additionally,the 60-nmol/L GAPDH-siRNA group showed the lowest GAPDH mRNA expression（all P＜0.05）,as well as the best transfection efficiency.The mRNA expression of Wnt5A differed in the Wnt5A-siRNA-793 group,Wnt5A-siRNA-943 group,Wnt5A-siRNA-1743 group and the blank control group（0.331±0.010,2.229±0.029,0.078±0.006 and 1.000±0.024 respectively;F=7 006.094,P＜0.05）,and the Wnt5A-siRNA-1743 group showed the lowest Wnt5A mRNA expression（all P ＜ 0.05）,as well as the best transfection efficiency.The mRNA expression of Wnt5A differed among the Wnt5A-siRNA-1743 group after 24-,48-and 72-hour treatment and the blank control group（0.396±0.002,0.026±0.008,0.131±0.079,1.025±0.276 respectively;F=29.215,P＜0.05）,so did the protein expression of Wnt5A（112.798±0.218,77.765±0.415,30.540±0.219,130.025±0.158 respectively;F=79 122.889,P＜0.05）.Moreover,the Wnt5A mRNA expression was significantly lower in the Wnt5A-siRNA-1743 group at 48 hours compared with that at 24 and 72 hours and the blank control group（all P ＜ 0.05）,while the Wnt5A protein expression was significantly lower in the Wnt5A-siRNA-1743 group at 72 hours compared with that at 24 and 48 hours and the blank control group（all P ＜ 0.05）.Conclusion The siRNA-mediated Wnt5A gene silencing model of human melanocytes is established successfully.

Melanocytes;RNA,small interfering;Gene silencing;Wnt5A

林彤，Email：ddlin@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.10.003

江苏省自然科学基金（BK2012507）

Fund program:Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK2012507）

2016-08-05）

（本文编辑：朱思维 颜艳）