河南省麦田猪殃殃对苯磺隆的抗性及ALS基因突变研究

高新菊,郭秀玲,陈 威,包来仓,马毅辉,秦光宇,祖均怀,王恒亮

(1.河南省农业科学院植物保护研究所/河南省农作物病虫害防治重点实验室/农业部华北南部作物有害生物综合治理重点实验室/河南省作物保护国际联合实验室/河南省生物农药工程研究中心，河南郑州 450002；2.郸城县农业科学研究所，河南郸城 477150； 3.河南省农药检定站，河南郑州 450002)

河南省麦田猪殃殃对苯磺隆的抗性及ALS基因突变研究

高新菊1,郭秀玲2,陈 威1,包来仓3,马毅辉1,秦光宇1,祖均怀1,王恒亮1

(1.河南省农业科学院植物保护研究所/河南省农作物病虫害防治重点实验室/农业部华北南部作物有害生物综合治理重点实验室/河南省作物保护国际联合实验室/河南省生物农药工程研究中心，河南郑州 450002；2.郸城县农业科学研究所，河南郸城 477150； 3.河南省农药检定站，河南郑州 450002)

为明确河南省部分地区麦田猪殃殃对苯磺隆的抗性水平及抗性靶标分子机制，对18个猪殃殃种群进行了乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)离体活性测定和ALS基因突变分析。结果表明，种群PDS-1、ZK-1、LH-1对苯磺隆产生了较高的抗性，ALS离体活性测定所得I50分别为11.27、10.26、8.19 μmol·L-1，抗性指数分别为93.92、85.50、68.25。种群ZK-1的6个检测株中，ALS基因第590位的C突变为T，ALS酶第197位脯氨酸(CCC)突变为亮氨酸(CTC)；种群PDS-1的6个检测株中，ALS基因第1 128位的T突变为A，ALS酶第376位天冬氨酸(GAT)全部突变为谷氨酸(GAA)；种群LH-1的6个检测株中，3株未检测到突变，另外3株的ALS基因第1 128位的T突变为G，ALS酶第376位天冬氨酸(GAT)突变为谷氨酸(GAG)。靶标ALS基因突变可能是猪殃殃对苯磺隆产生高抗性的重要原因之一。

河南省；猪殃殃；苯磺隆；抗性；ALS基因突变

乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)抑制剂类除草剂是一类广泛应用的除草剂，但其作用位点单一，长期、单一施用使杂草对其比较容易产生抗性[1-2]。截至2016年8月，全球已有159种杂草对ALS抑制剂类除草剂产生了抗性，使其成为抗性上升最快的一类除草剂[3]。苯磺隆(tribenuron-methyl)是由美国杜邦(DuPont)公司开发的一种ALS抑制剂类除草剂，在我国主要用于小麦田一年生阔叶杂草的防除，是我国使用面积最大、期限最长的除草剂品种之一。目前，我国许多地区的小麦田阔叶杂草，如播娘蒿(Descurainiasophia)[4-6]、荠菜(Capsellabursa-pastoris)[7-9]、麦家公(Lithospermumarvense)[10]等对苯磺隆的抗性水平已被相继报道，其抗性问题日益突出。研究发现，ALS基因保守区的氨基酸突变是播娘蒿[4,6]、荠菜[8,11]对苯磺隆产生高水平抗性的重要原因之一。

猪殃殃(Galiumaparine)为茜草科猪殃殃属杂草，攀援或蔓生，是我国冬小麦田的主要阔叶杂草之一，严重影响小麦产量及收割。目前，猪殃殃对苯磺隆的抗性水平及抗性分子机制已被一些学者报道。彭学岗等[12]采用温室盆栽法和培养皿法测定了河南、安徽、山东、江苏、河北、山西、陕西部分地区的猪殃殃对苯磺隆的抗性水平，其中，河南省许昌采集点抗药性最高，温室盆栽法和培养皿法测得抗性指数分别为4.3和2.2倍。Sun等[13]通过对敏感和抗药型猪殃殃的ALS测序发现，与敏感型猪殃殃相比，抗药型ALS第574位色氨酸被甘氨酸取代，这可能是猪殃殃对苯磺隆产生抗药性的重要原因之一。目前，就河南省大部分地区麦田猪殃殃种群对苯磺隆的抗性水平及抗性分子机制尚未见报道。

本研究拟对河南省部分小麦主产区的18个猪殃殃种群进行ALS离体活性测定和ALS基因突变分析，以明确河南省不同地区猪殃殃种群对苯磺隆的抗性水平及抗性靶标分子机制，为制定合理、有效的防治对策、科学使用除草剂防治抗药性杂草提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试猪殃殃种子：2013年5月底和2014年5月底采集于平顶山市、周口市等18个采样点的小麦田，详见表1。每个采样点面积300～600 m2，所采集的猪殃殃种子混合作为一个种群。

1.2 方 法

1.2.1 试材培养

在直径12 cm的塑料盆钵内，装入风干过筛、混匀后的壤土，每盆播种经0.05%赤霉素处理24 h 后培养至露白的猪殃殃种子20粒，置于人工气候箱(MGC-350HP型，上海天呈)内培养。光暗比14 h/10 h，温度22 ℃/15 ℃，相对湿度为75%。出苗后，每盆定苗10株。

1.2.2 ALS离体活性测定

酶液制备：参考Ray[14]的方法，略有改动。将3～5轮叶期猪殃殃地上部分剪碎，取1 g放入预冷的研钵中，加入适量液氮快速研磨成细粉，再加入4 mL匀浆缓冲液[含1 mmol·L-1丙酮酸钠(美国Amresco公司)，0.5 mmol·L-1氯化镁，0.5 mmol·L-1TPP(氯化硫胺素焦磷酸盐，索莱宝)和10 μmol·L-1FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸，索莱宝)的0.1 mol·L-1pH 7.0的磷酸缓冲液]快速研磨，置于离心管中，用匀浆缓冲液定容至8 mL，用SORVALL Stratos冷冻型高速离心机(赛默飞世尔科技)于25 000 r·min-1、4 ℃下离心20 min；取上清液，缓慢加入硫酸铵晶体至50%饱和度，沉淀2 h后，于25 000 r·min-1、4 ℃下离心30 min；弃上清液，将沉淀用6 mL重悬浮缓冲液(含20 mmol·L-1丙酮酸钠和0.5 mmol·L-1氯化镁的0.1 mol·L-1pH 7.0的磷酸缓冲液)重新悬浮，即得酶液，4 ℃保存，待测，每个处理重复3次。

ALS活力测定：参考范志金等[15]的方法。在10 mL具塞试管中加入0.9 mL酶反应液(含20 mmol·L-1丙酮酸钠，0.5 mmol·L-1氯化镁，0.5 mmol·L-1TPP和10 μmol·L-1FAD的0.1 mol·L-1pH 7.0的磷酸缓冲液)、1 mL酶液和0.1 mL不同浓度的苯磺隆(98%原药，山东华阳科技)药液，使苯磺隆终浓度分别为0.01、0.1、1、10、100、1 000 μmol·L-1，以加入0.1 mL蒸馏水的处理为对照。摇匀后置于35 ℃恒温水浴中，1 h后加入0.2 mL 3 mol·L-1的硫酸终止反应；60 ℃水浴15 min后，分别加入1 mL 0.5%肌酸和5% α-萘酚(用2.5 mol·L-1的氢氧化钠溶液配制)；60 ℃水浴显色15 min，迅速置于冰浴中冷却1 min，用752紫外可见分光光度计于525 nm 波长下测定吸光度值A525。计算各处理的ALS相对活性，ALS相对活性=不同苯磺隆浓度处理的A525/空白对照的A525×100%。

表1 猪殃殃采集地点与苯磺隆用药历史Table 1 Collecting sites of Galium aparine and their background of tribenuron-methyl application

1.2.3ALS基因突变分析

引物设计：根据猪殃殃ALS基因序列(GenBank登录号：GU377313)，利用Primer Premier 5.0软件设计3对引物(表2)，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，扩增片段包含目前已报道抗性杂草ALS基因保守区的8个突变位点，这些位点对应拟南芥(Arabidopsisthaliana)的ALS氨基酸分别是Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653和Gly654[16-18]。

DNA提取、扩增及测序：用新型植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技)对18个种群的3～5轮叶期猪殃殃叶片进行单株DNA提取，每个种群6株。每个DNA样本的PCR扩增(9700型PCR扩增仪，美国ABI公司)重复3次。PCR反应体系为：Taq酶(宝生物)0.25 μL、10×PCR Buffer 5 μL、25 mmol·L-1MgCl23 μL、dNTP mix(2.5 mmol·L-1)4 μL、模板DNA 2 μL、上下游引物各2 μL，灭菌ddH2O补足50 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技)回收后送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。将测序完成的目的DNA片段序列与拟南芥敏感生物型的ALS基因序列用DNAMAN软件进行序列比对，寻找突变位点。

表2 扩增猪殃殃ALS基因片段的引物Table 2 Primers for ALS gene of Galium aparine

1.3 数据处理

ALS离体活性测定得到的数据参考Seefeldt等[19]的方法进行分析。使用Sigma Plot 12.5软件中非线性回归方程y=C+(D-C)/[1+(x/I50)b]进行剂量反应曲线拟合，计算各种群的I50。式中，y为特定除草剂用量下所测杂草的ALS相对活性；C为剂量反应下限；D为剂量反应上限；x为除草剂用量；I50为猪殃殃不同生物型ALS活性被抑制50%时的苯磺隆浓度；b为斜率。

抗性指数(RI)=抗性种群的I50/敏感种群的I50。

2 结果与分析

2.1 离体条件下苯磺隆对猪殃殃ALS活性的影响

由表3可知，猪殃殃种群XX-1的ALS对苯磺隆最敏感，其I50仅为0.12 μmol·L-1(抗性指数为1.00)；猪殃殃种群PDS-1、ZK-1、LH-1对苯磺隆的I50分别为11.27、10.26、8.19 μmol·L-1，其抗性指数分别为93.92、85.50、68.25，表明这些采集点的猪殃殃种群的ALS对苯磺隆的敏感性明显降低；其他采集点猪殃殃种群的I50在0.20～1.14 μmol·L-1之间，抗性指数在1.67～9.50之间。

2.2 不同猪殃殃种群ALS基因突变分析

与拟南芥敏感生物型及不同猪殃殃种群间的ALS基因对比分析可知(表4)，猪殃殃种群ZK-1的6个检测株中，ALS基因第590位碱基C突变为T，导致ALS酶的第197位脯氨酸(CCC)突变为亮氨酸(CTC)；种群PDS-1的6个检测株中，ALS基因第1 128位的T突变为A，导致ALS酶第376位天冬氨酸(GAT)突变为谷氨酸(GAA)；种群LH-1的6个检测株中，3株未检测到突变，另外3株的ALS基因第1 128位的T突变为G，导致ALS酶第376位天冬氨酸(GAT)突变为谷氨酸(GAG)；其他种群均未检测到突变。

表3 苯磺隆对不同猪殃殃种群ALS离体活性的抑制作用Table 3 Inhibition of tribenuron-methyl on ALS activity in vitro of different populations of Galium aparine

C：剂量反应下限；D：剂量反应上限；I50：ALS离体活性抑制中浓度；b：斜率；R：相关系数；RI：抗性指数。

CandD：Lower and upper limit of dose-dependent response,respectively;I50：The tribenuron-methyl concentration required for 50% inhibition of ALS activityinvitro;b：The slope at theI50;R：Correlation coefficient;RI：Resistance index.

表4 猪殃殃种群ALS基因突变点及相应的氨基酸Table 4 Mutant of ALS gene and amino acid sequences among different populations of Galium aparine

3 讨 论

离体条件下，靶标酶相对活性测定可以反映供试杂草对除草剂的抗药性[20]。本研究中，由于种群XX-1的采集点从未施用过除草剂，其ALS离体活性的I50仅为0.12 μmol·L-1，在供试的18个种群中最低，对苯磺隆比较敏感；而猪殃殃种群PDS-1、ZK-1、LH-1的I50分别为11.27、10.26、8.19 μmol·L-1，相对于种群XX-1的抗性指数分别为93.92、85.50、68.25，表明这些采集点猪殃殃种群的ALS对苯磺隆有较高的抗性。这与Han等[21]对播娘蒿ALS的研究结果类似。

杂草体内除草剂作用位点发生改变、杂草代谢解毒能力增强、杂草的屏蔽作用或与作用位点的隔离作用是杂草对除草剂产生抗性的三大主要机制，其中，靶标基因突变是最重要的原因之一[22]。本研究通过对不同猪殃殃种群的ALS基因片段扩增并测序发现，与敏感型拟南芥和猪殃殃的ALS相比，猪殃殃种群ZK-1的6个检测株中，ALS基因第950位碱基C突变为T，使相应的197位脯氨酸为亮氨酸；种群PDS-1的6个检测株中，ALS基因第1 128位的T突变为A，使相应的376位天冬氨酸变为谷氨酸；种群LH-1的6个检测株中，3株未检测到突变，另外3株的ALS基因第1 128位的T突变为G，使相应的376位天冬氨酸变为谷氨酸，这可能是导致猪殃殃对苯磺隆产生高抗性的重要原因之一。Sun等[13]发现抗苯磺隆猪殃殃的ALS第574位色氨酸被甘氨酸取代，本研究中ALS第197位脯氨酸被亮氨酸取代，第376位天冬氨酸被谷氨酸取代是在抗苯磺隆猪殃殃中首次发现。

本课题组对供试的猪殃殃种群进行了整株抗性测定，发现其抗性水平与ALS离体活性测定所得抗性水平基本一致。本研究中靶标ALS基因检测明确了河南省部分地区麦田猪殃殃对苯磺隆的抗性机理，但有关解毒代谢酶与抗药性的关系、交互抗性等问题有待于进一步研究。

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ResistancetoTribenuron-MethylandALSMutationsinGaliumaparineinWheatFieldsinHenanProvince

GAOXinju1,GUOXiuling2,CHENWei1,BAOLaicang3,MAYihui1,QINGuangyu1,ZUJunhuai1,WANGHengliang1

(1.Henan Key Laboratory of Crop Pest Control/IPM Key Laboratory in Southern Part of North China for Ministry of Agriculture/ International Joint Research Laboratory for Crop Protection of Henan/Biological Pesticides Engineering Research Center of Henan Province/Institute of Plant Protection,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou,Henan 450002,China; 2.Dancheng Institute of Agricultural Sciences,Dancheng,Henan 477150,China; 3.Institute for the Control of Agrochemicals of Henan province,Zhengzhou,Henan 450002,China)

To investigate the resistance levels and molecular mechanism ofGaliumaparineto tribenuron-methyl in winter wheat fields in Henan province,eighteenGaliumaparinepopulations were assessed by acetolactate synthase(ALS) activityinvitroassay and analysis ofALSmutations.The results showed thatGaliumaparinepopulations PDS-1,ZK-1,and LH-1 had higher levels of resistance than those of others,and theirI50of ALS activityinvitroassay were 11.27,10.26 and 8.19 μmol·L-1,respectively,and the corresponding relative resistance index were 93.92,85.50 and 68.25,respectively.ALSsequences analysis indicated that C→T at 590th base proline(CCC) at position 197 of the ALS was substituted by leucine(CTC) in six PDS-1 plants.Aspartic acid(GAT) at position 376 was substituted by glutamic acid(GAA) in six ZK-1 plants.Aspartic acid(GAT) at position 376 was substituted by glutamic acid(GAT) in three LH-1 plants.The Pro197 or Asp376 mutations in ALS could be one of important reasons for the observed high resistance to tribenuron-methyl.

Henan province;Galiumaparine; Tribenuron-methyl; Resistance;ALSmutation

时间：2017-11-14

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20171114.1028.032.html

2017-01-06

2017-04-26

河南省农业科学院自主创新专项(2013ZZ22,2016ZC43)

E-mail：gaoxj19@qq.com(高新菊)；E-mail:hlw2000@126.com(王恒亮，与第一作者同等贡献)

王恒亮(E-mail:hlw2000@126.com)

S512.1；S451.1

A

1009-1041(2017)11-1518-07