溃疡性结肠炎患者外周血中IL-32表达水平及其意义

陈亮 ，汪启斌 ，董荣坤 ，黄建朋 ，汪彪 ，张健 ，王佩，甘云辉，张征，梁俊

（1.湖北医药学院附属人民医院 胃肠外科，湖北 十堰 442200；2.中山大学附属第七医院 胃肠外科，广东 深圳 518107）

溃疡性结肠炎患者外周血中IL-32表达水平及其意义

陈亮1，汪启斌1，董荣坤1，黄建朋2，汪彪1，张健1，王佩1，甘云辉1，张征1，梁俊1

（1.湖北医药学院附属人民医院 胃肠外科，湖北 十堰 442200；2.中山大学附属第七医院 胃肠外科，广东 深圳 518107）

目的检测溃疡性结肠炎（UC）患者外周血中白细胞介素32（IL-32）表达水平，分析IL-32表达水平与UC严重程度的关系。方法入组50例UC患者（UC组，根据病情分为轻、中、重度）及30例健康体检者（对照组），分别收集UC组和对照组患者的外周血，用Trizol提取外周血中淋巴细胞总RNA，实时聚合酶链反应检测IL-32 mRNA表达水平；用酶联免疫吸附法检测外周血中IL-32蛋白表达水平，比较两组外周血中IL-32表达水平，以及轻、中、重度UC患者IL-32表达水平。结果UC患者外周血中IL-32 mRNA和蛋白表达水平与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；重度UC患者外周血中IL-32表达水平与轻、中度比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论UC患者外周血中IL-32表达增高，IL-32可能参与UC的发病。

溃疡性结肠炎；白细胞介素32；外周血

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是慢性、非特异性、肠道炎症性疾病，病变主要累及乙状结肠和直肠，亦可累及全部结肠，肠道炎症常反复发生，易引起中毒性结肠扩张、癌变等并发症，其发病机制尚未完全明确[1]。目前研究认为，肠壁黏膜免疫调节异常、持续肠道感染及细胞因子等与UC的发病密切相关。白细胞介素32（Interleukin-32，IL-32）是一种促炎症细胞因子，可以活化核转录因子-kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、激活子蛋白-1（activator protein 1，AP-1）、分裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK） 信 号通路诱导肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素8（Interleukin-8，IL-8）等细胞因子表达，与风湿性关节炎等炎症性疾病的发病密切相关[2-4]。因此，本研究收集UC患者外周血标本，检测IL-32表达水平，分析其与UC患者病情严重程度的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2013年9月-2014年9月在湖北医药学院附属人民医院消化内科、胃肠外科诊断为UC的患者50例。其中，男性20例，女性30例；年龄20～65岁，平均（40.8±8.6）岁。UC的诊断标准参照《2010年世界胃肠病学组织关于炎症性肠病诊断和治疗的实践指南》[5]制定的诊断标准。UC患者根据病情进行分级：轻度16例，中度20例，重度14。对照组30例为本院体检中心体检的健康居民。其中，男性14例，女性16例；年龄19～62岁，平均（40.2±7.8）岁。两组患者在性别、年龄上比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 标本收集

UC组和对照组于晨起采空腹肘静脉血10 ml，取4 ml放入非抗凝干燥无菌真空管中，室温静置1 h自行凝固，1 300 r/min离心15 min，取上清液分装于离心管内，置于-80℃冰箱低温冷冻保存。取6 ml放入含肝素的无菌抗凝管，Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞。

1.3 RNA提取及实时聚合酶链反应

用Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司）提取细胞总RNA，具体步骤按说明书操作。用逆转录试剂盒（日本Toyobo公司）将提取的细胞总RNA逆转录为cDNA，按说明书操作。然后用实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）Faststart Universal SYBR Green Master（Rox）试剂盒（瑞士Roche公司）扩增，按说明书操作。扩增IL-32正向引物：5’-CGACTTCAAAGAGGGCTACC-3’，反向引物：5’-GAGTGAGCTCTGGGTGCTG-3’[6]。用β-actin作为内参，应用SYBR Green荧光染料进行real-time PCR反应，获得各组织标本的扩增曲线，计算机分析Ct值。基于Ct值来评估检测样品变化的相对值。

1.4 酶联免疫吸附法

血清中IL-32蛋白表达水平用美国Biolegend公司的酶联免疫吸附法试剂盒检测，具体步骤按说明书操作。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组比较用t检验，多组比较用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UC患者外周血中IL-32 mRNA表达增高

UC组IL-32mRNA表达水平为（3.07±0.29），对照组为（1.00±0.12），经t检验，差异有统计学意义（t=6.157，P=0.009），UC组IL-32 mRNA表达水平高于对照组。见图1。

2.2 UC患者外周血中IL-32蛋白表达增高

UC组IL-32蛋白表达水平为（156.67±23.33）pg/ml，对照组为（48.337±4.41）pg/ml，经t检验，差异有统计学意义（t=4.562，P=0.010），UC组IL-32蛋白表达水平高于对照组。见图2。

2.3 不同病情程度UC患者血清IL-32表达水平比较

轻度患者血清IL-32表达水平为（116.67±15.28）pg/ml，中度患者为（153.33±15.26）pg/ml，重度患者为（223.34±25.17）pg/ml，经方差分析，差异有统计学意义（F=24.030，P=0.001），重度患者IL-32表达水平高于轻、中度患者。

图1 两组患者外周血中IL-32 mRNA表达水平（±s）

图2 两组患者外周血中IL-32蛋白表达水平（±s）

3 讨论

本研究发现UC患者外周血中IL-32表达水平升高，且IL-32表达水平随着UC病情严重程度增加而升高。UC是一种炎症性肠病，主要特点是直肠、乙状结肠等反复发作的炎症，可引起癌变、出血等并发症，其发病机制尚未完全明确。目前研究认为，免疫调节异常在UC发病中发挥重要作用。细胞因子在免疫调节中起关键作用，细胞因子表达异常与多种免疫性疾病的发病密切相关。比如风湿性关节炎患者关节腔中IL-32表达增高，与风湿性关节炎的发病密切相关[4]。因此，笔者推测IL-32可能参与UC的发病。

IL-32是一种新发现的促炎症细胞因子，可以通过活化NF-κB、AP-1、p38MAPK信号通路，诱导单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞等表达TNF-α、IL-6、IL-8及白细胞介素1β等细胞因子，而白细胞介素1β、TNF-α及干扰素-γ等细胞因子均可诱导肠上皮细胞等表达IL-32，相互影响导致肠内细胞因子网络活化，免疫调节异常，最终导致炎症性肠损伤，发生炎症性肠病[2-3，7-8]。

最新研究发现，肠上皮细胞表达IL-32，炎症性肠病肠组织中IL-32表达升高，认为促炎症细胞因子IL-32可能涉及炎症性肠病的发病[7-8]。本研究发现，UC患者外周血中IL-32表达升高，且表达水平随病情严重程度增加而升高，因此笔者认为IL-32可能参与UC发病，笔者的研究进一步证实IL-32在UC发病中的作用。

综上所述，本研究发现UC患者外周血中IL-32表达升高，且IL-32表达水平随着UC病情严重程度增加而升高，因此笔者认为IL-32可能参与UC的发病。

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（童颖丹 编辑）

Expression of serum IL-32 level in patients with ulcerative colitis and its significance

Liang Chen1, Qi-bin Wang1, Rong-kun Dong1, Jian-peng Huang2, Biao Wang1,Jian Zhang1, Pei Wang1, Yun-hui Gan1, Zheng Zhang1, Jun Liang1
(1. Department of Gastrointestinal Surgery, Renmin Hospital of Hubei University of Medicine, Shiyan,Hubei 442200, China; 2. Department of Gastrointestinal Surgery, the Seventh Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Shenzhen, Guangdong 518107, China)

ObjectiveTo investigate serum IL-32 level in patients with ulcerative colitis (UC) and its relationship with the severity of UC.MethodsFifty UC patients (16 mild cases, 20 moderate cases and 14 severe cases) and 30 healthy controls were enrolled in the present study. Peripheral blood of the UC patients and the healthy controls was collected respectively. Total RNA in PBMCs was extracted by TRIzol Reagent. IL-32 mRNA expression level was detected by real-time PCR. IL-32 protein expression level in serum was assayed by ELSIA.Difference in IL-32 expression level between the UC and control groups was compared using student’sttest.Differences in IL-32 expression level among the mild, moderate and severe UC groups were compared using analysis of variance.ResultsSerum IL-32 expression level of the UC patients was higher than that of the healthy controls both at RNA and protein levels (P＜ 0.05). Serum IL-32 expression in the severe UC group was statistically higher than that in the moderate and mild UC groups, respectively (P＜ 0.05).ConclusionsSerum IL-32 expression in UC patients is increased. IL-32 might be involved in the pathogenesis of UC.Keywords: ulcerative colitis; IL-32; peripheral blood

R574.62

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.29.020

1005-8982（2017）29-0094-03

2016-03-07

黄建朋，E-mail：aiabao999@163.com