万古霉素单用及联合用药对MRSA耐药性的影响

翟蕙，李家斌

（安徽医科大学第一附属医院 感染科，安徽 合肥 230022）

万古霉素单用及联合用药对MRSA耐药性的影响

翟蕙，李家斌

（安徽医科大学第一附属医院 感染科，安徽 合肥 230022）

目的培养耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的临床分离菌株，比较万古霉素单用与联合其他抗生素对MRSA的影响。方法采用琼脂平板倍比稀释法配置肉汤培养基，培养1×1010CFU/ml浓度的细菌，测定上述抗菌药物单用及联合使用对10株MRSA临床分离株的防耐药突变浓度（MPC），并计算相应的选择指数（SI）和耐药频率。结果万古霉素单独用药组中，对MRSA的SI为16～64；万古霉素与利福平联合应用时，SI为2～6；万古霉素与磷霉素联合应用时，SI为1～8；并且耐药频率也呈下降趋势。结论万古霉素分别与利福平、磷霉素联合使用，可降低其单用的MPC，缩小耐药突变选择窗，防止耐药突变菌的产生。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；万古霉素；联合用药；防耐药突变浓度；耐药突变选择窗；耐药频率

万古霉素的抗菌谱主要针对革兰阳性菌，其中最有效的是抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的感染。由于耐药菌菌属范围不断扩大，对耐药菌的抑制显得尤为重要，这也凸显出万古霉素在治疗MRSA感染中的重要性[1-2]。按照耐药突变选择窗（mutant selection windows，MSW）理论确定细菌耐药性的产生和标准，监测其血药谷浓度，评价血药谷浓度与临床疗效的关系，为临床制定个体化方案，实现合理化用药具有重要意义[3-4]。

1 材料与方法

1.1 菌株来源与鉴定

耐药菌种主要为安徽省细菌耐药监测中心2014～2015年上报的耐药菌种类。根据菌种的药敏性质将MRSA挑选出来，并且保证挑出的菌种对磷霉素的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）≤16.0μg/ml，共10个菌株。依据参考文献[5]确定MRSA的菌属特征。

1.2 培养基与仪器

MH培养基（英国Oxiod公司），恒温振荡培养箱（江苏国胜仪器厂），细菌比浊仪（英国Oxiod公司），32 R低温离心机（德国Hettich公司），多点接种仪（英国 AQS Manufacturing 公司）。

1.3 抗菌药物及试剂

万古霉素标准品（纯度100%）、磷霉素标准品（低聚果糖低聚果糖纯度99%）购自北京中国药品生物制品检定所。利福平（RET脂蛋白纯度97%）、6-磷酸葡萄糖（500 mg/瓶，纯度98%～100%）购自美国Sigma公司。

1.4 MIC测定

测定方式为琼脂平板倍比稀释法，依据美国临床实验室标准化委员会2010年标准中规定的详细指标进行分析[6]。针对磷霉素的MIC测定也要按照琼脂稀释法操作，根据美国临床实验室标准化委员会对MIC的测定规定[6]，需要将6-磷酸葡萄糖以25μg/ml的浓度加入琼脂平板中。

1.5 防耐药突变浓度的测定

1.5.1 含单药琼脂平板的配制 研究对象的防耐药突变浓度（mutation preventive concentration，MPC）测定根据参考文献[7]。将琼脂平板分为7个不同浓度，对应每种药物单独的MIC。药物终浓度分别为各菌株的1×MIC、2×MIC……64×MIC。每个浓度配制4个平板。配置好浓度为25μg/ml的6-磷酸葡萄糖，分别滴入各组的琼脂板，测出磷霉素的MPC值。

1.5.2 含2种药物琼脂平板的配制 将万古霉素配制为几组不同浓度值的1 ml液体，同时配制1 ml RET脂蛋白，浓度设置为4.0μg/ml，MH琼脂18 ml，将几种材料置于90 mm培养皿中混合。将不同浓度的含有2种抗生素联合抑菌的琼脂平板进行标记，平均每个浓度的琼脂平板保留4个样本。

1.5.3 MPC、选择指数及耐药频率的测定 将培养好的菌落接种于新的MH培养基（20 ml）中，37℃恒温培养箱中震荡培养12 h。3 000 r/min离心后去上清，将沉淀物混入新的培养基中，继续震荡培养菌落6 h后再次离心操作，用比浊仪检测整体溶液的浓度，将其控制在3×1010CFU/ml。将之前制作的不同浓度的琼脂平板标记好，吸出最终确定浓度的菌落液体100 ml，将其均匀涂抹在琼脂平板上，不同浓度的琼脂板各保留4个样本，每个样本涂抹1.2×1010CFU的菌液。35℃培养72 h，以无细菌生长的最低药物浓度为MPC。保留耐药菌的突变基因。选择指数（selection index，SI）=MPC/MIC。耐药频率=琼脂平板上测定的菌落数值/实验接种的菌落数值。以上实验重复3次，取其平均值。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组比较用t检验，多组比较用方差分析，方差齐则两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗菌药物的MIC比较

万古霉素、利福平及磷霉素的MIC分别为（0.950±0.497）、（0.009±0.004） 和（9.300±6.325）μg/ml，经方差分析，差异有统计学意义（F=19.491，P=0.000）。见表 1。

2.2 抗菌药物单用及联合使用对MPC和SI的影响

万古霉素与利福平、磷霉素联合使用的MPC分别为（7.800±3.584）和（3.600±2.011）μg/ml，万古霉素单用时MPC为（30.400±14.095）μg/ml。经方差分析，差异有统计学意义（F=29.242，P=0.000）。

万古霉素与利福平、磷霉素联合使用的SI分别为（8.600±4.427）和（3.800±1.932），万古霉素单用时SI为（32.000±13.064）。其SI比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=35.202，P=0.000）。万古霉素联合利福平和万古霉素联合磷霉素的SI优于万古霉素单用（P＜0.05）。见表 2。

2.3 万古霉素对MRSA耐药频率的影响

万古霉素单用 1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC及 32×MIC对 10株 MRSA的 耐药频率分别为1.50×10-5～ 2.54×10-6、2.42×10-6～1.86×10-7、7.85×10-6～ 5.66×10-7、3.28×10-7～1.61×10-8、1.70×10-8～ 3.34×10-9和 2.34×10-9。

2.4 万古霉素与利福平联合使用对MRSA耐药频率的影响

万古霉素单用及与利福平联合使用对MRSA的耐药频率分别为：1×MIC（8.77×10-6±7.28×10-6）和（2.68×10-8±2.07×10-8）；2×MIC（1.23×10-6±1.02×10-6）和（2.01×10-8±1.21×10-8）；4×MIC（4.20×10-7±3.34×10-7） 和（6.26×10-9±6.44×10-9）经t检验，差异有统计学意义（t=4.826、4.574和4.356，P=0.003、0.002和0.001），万古霉素与利福平联用时耐药频率优于万古霉素单用。见表3。

2.5 万古霉素与磷霉素联合使用对MRSA耐药频率的影响

万古霉素与磷霉素、万古霉素与利福平联合使用对MRSA的耐药频率分别为：1×MIC（1.42×10-7±1.24×10-7）和（2.68×10-8±2.07×10-8）；2×MIC（8.59×10-8±1.03×10-7）和（2.01×10-8±1.21×10-8）；4×MIC（1.47×10-7±1.43×10-7）和（6.26×10-9± 6.44×10-9），其与万古霉素单用3种耐药频率比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=16.582，P=0.000）。万古霉素与磷霉素、利福平联合使用的耐药频率与其单用比较，经t检验，差异有统计学意义（t=4.901，P=0.004），万古霉素与磷霉素、利福平联合使用的耐药频率优于万古霉素单用。见表4。

表1 3种抗菌药物的MIC比较 （μg/ml）

表2 万古霉素单用及联合使用对MPC和SI的影响

表3 万古霉素与利福平联合使用对MRSA耐药频率的影响

表4 万古霉素与磷霉素联合使用对MRSA耐药频率的影响

3 讨论

随着抗生素的普及，人类治疗疾病有了革命性的进步。但是由于人类对医疗认知的不足，导致抗生素在过去一个世纪被大量滥用，最终导致大量耐药菌的产生。其中包括MRSA，其在院内感染的细菌菌种中最高发，患者死亡率居高不下。对于MRSA的治疗一直采用万古霉素单一的抗生素，但是临床研究提出万古霉素的治愈率＜60%[8]。这在一定程度上证明，MRSA已经出现基因突变，对万古霉素产生耐药菌株。MSW理论认为，细菌的MPC值较抗生素浓度低时，需要病原菌进行自身的基因突变，并且要达到2次传代繁殖时，耐药基因才能稳定，连续2次传代的基因突变在概率上微乎其微。由此可见，在判断细菌对抗生素的耐药性时，可以将MPC值作为一个重要指标。胡晖等[9]在相关临床药物研究报告中提出，其实验中检测122株MRSA的临床分离菌株在经过万古霉素干扰时的MPC值的变化，得出结果为MPC 90值达22.4μg/ml。本实验中，最终得到的数据为16～64μg/ml，与胡晖等[9]一致。万古霉素很难进入组织器官的代谢屏障，难以达到预期效果，因此临床上一般将万古霉素与其他抗生素联合应用，以控制细菌感染[10-12]。

李朝霞等[13]对万古霉素与左氧氟沙星在临床抗感染治疗中的疗效进行比较，结果表明，联合用药的观察组对金黄色葡萄球菌ATCC29213的MSW影响减少4～8倍。ZHANEL等[14]也比较了万古霉素与其他多种抗生素联合用药的效果，结果显示，万古霉素与其他抗生素联合应用时，测试菌株的SI呈明显的下降趋势。而研究显示，万古霉素等抗生素依然对MRSA具有较高的药物敏感性[15-16]。

虽然利福平对10株MRSA的MIC≤0.016μg/ml，MPC却高到无法测出（＞1 024μg/ml），而磷霉素的MPC则为128～1 024μg/ml，其MSW较利福平窄的多。由此可见，单独用药的MSW与联合用药的MPC下降幅度呈负相关，与喻婷[17]、梅清等[18]的研究结果一致。

当万古霉素与利福平、磷霉素联合应用时，细菌的耐药突变频率呈现下降趋势。联合用药进行抗感染治疗后，细菌菌株中依然有耐药基因表达的出现，但是耐药基因突变的数量急剧减少，不足以引起大规模耐药菌的繁殖。

大量的临床抗感染治疗都需要联合使用抗生素。万古霉素在控制细菌感染中也有与其他抗生素联合使用的情况，该治疗方案得到了药理学的理论支持[19-21]。本实验结果表明，万古霉素与利福平、磷霉素联合使用能够降低耐药菌的耐药基因突变概率，使耐药基因在菌株细胞中难以表达，达到控制MRSA大规模增殖感染的目的。因为药物进入人体血浆代谢过程中，随着机体代谢速率的变化，其血浆清除率和药物代谢率都处于变化的状态，所以本研究结果还需临床验证。

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（童颖丹 编辑）

Effect of single use and combined use of Vancomycin on drug resistance of MRSA

Hui Zhai, Jia-bin Li
(Department of Infectious Diseases, the First Aff i liated Hospital of Anhui Medical University,Hefei, Anhui 230022, China)

ObjectiveTo culture the clinical isolates of Methicillin-resistantStaphylococcus aureus(MRSA)and compare the efficacy of single and combined use of Vancomycin against MRSA infection.MethodsAgar dilution method was applied to confect broth culture medium, which was used to culture 1×1010CFU/ml concentration of bacteria. The mutant prevention concentrations of single and combined use of Vancomycin for 10 clinical isolates of MRSA were determined, and then the corresponding selection index and the frequency of drug resistance were calculated.ResultsFor the 10 MRSA isolates, the selection indexes of Vancomycin used alone were 16-64, the selection indexes of Vancomycin combined with Rifampicin were 2-6, and the selection indexes of Vancomycin combined with Fosfomycin were 1-8; meanwhile the frequency of drug resistance showed a downward trend.ConclusionsCompared to single use, Vancomycin combined with Rifampin or Fosfomycin can reduce the mutant prevention concentration for MRSA, and narrow the drug-resistant mutant selection window, and prevent the production of drug-resistant mutant bacteria.

Methicillin-resistantStaphylococcus aureus; Vancomycin; drug combination; mutant prevention concentration; drug-resistant mutant selection window; frequency of drug resistance

R446.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.29.004

1005-8982（2017）29-0016-05

2016-09-23

李家斌，E-mail：lijiabin948@vip.sohu.com