茶油挥发性成分指纹图谱的构建及掺伪定量检测方法研究

周 波 ，孙亚娟 ，王进英 ，金 超 ，钟海雁

（1. 中南林业科技大学 食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004；2.粮油深加工与品质控制湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004；3. 经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，湖南 长沙 410004）

茶油挥发性成分指纹图谱的构建及掺伪定量检测方法研究

周 波1，2，3，孙亚娟1，2，3，王进英1，2，3，金 超1，2，3，钟海雁1，2，3

（1. 中南林业科技大学 食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004；2.粮油深加工与品质控制湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004；3. 经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，湖南 长沙 410004）

为探析茶油的挥发性成分指纹图谱，以20种不同产地、制备方法的茶油为原料，利用顶空固相微萃取（SPME）和气相色谱仪分析其挥发性成分。结果表明：（1）茶油挥发性成分的指纹图谱由壬醛、2-反己烯醛等17个共有色谱峰构成，且经聚类分析和相似度分析得出茶油的产地、储存时间，尤其是制备工艺对其影响较大；（2）选取一种茶油为研究对象，建立了菜籽油－茶油的掺伪模型：Y=-4 572.5X3+5 637.4X2-2 206.3X+364.05（Y为菜籽油掺假比例%，X为夹角余弦cosθ），适用于菜籽油掺伪量25%以上的茶油。

茶油；挥发性成分；指纹图谱；掺伪模型

油茶Camellia oleifera为山茶科山茶属常绿灌木或小乔木，是中国特有的木本油料树种，其籽所制备的油脂，即茶油，又名茶籽油、茶树油或山茶油，具有颜色清澈、味道香浓、营养丰富、耐贮藏等优点，不饱和脂肪酸含量高达90%，有“东方橄榄油”的称号[1]，是一种深受消费者喜爱的食用油，因而价格普遍较高[2-3]。目前，有些非法商贩以销售掺假茶油来牟取暴利[4]。茶油的气味、滋味是其质量控制的重要指标之一[5]。茶油具有区别其他常见食用油的特殊挥发性成分，主要由吡咯类、吡嗪类、吡啶类、噻唑类、噻吩类和呋喃类等化学成分组成[6]。对茶油的挥发性成分进行定性定量分析，已成为一种重要的质控手段[7]，但其大部分成分的浓度仅几百万分之几，甚至更小低，因而要完全鉴别具有一定的困难，比较科学的方法是立足于其特征值。

固相微萃取(Solid Phase Microextraction,SPME)技术是依靠纤维头从样品中吸附待测物，并解吸于分析设备中的一种无溶剂样品预处理技术，是当今色谱分析中使用极为广泛的样品前处理方法[8]。吴继红等[9]采用SPME-GC/MS技术分析了苹果中的香气成分，共鉴定出48 个成分。魏玉梅等人[10]将顶空固相微萃取和气相色谱质谱联用对花牛苹果的香气成分进行了分析，共分离鉴定出76 种化学成分。龙奇志等人[11]研究了茶油挥发性物质的固相微萃取的条件，认为当样品量为1.00 g(15 mL样品瓶)、搅拌速度为100 r/min、萃取温度为40 ℃、吸附时间为25 min、解析温度和时间分别为260℃和3 min时，萃取效果最好。

虽然指纹图谱在中药方面的应用比较普遍，但这并不妨碍指纹图谱在其他领域的应用[12]。气相色谱（Gas Chromatography, GC）对挥发性成分的分析能起到独特的作用，因此利用气相色谱法构建指纹图谱具有别样的意义。通过采用毛细管气相色谱法，夏稷子等[13]发现14个不同产地艾纳香药材的GC指纹图谱共有23个共有峰，不同产地艾纳香药材在所含成分的种类上差异不大，但在成分比例和数量上差异较大。张胜娜等[14]利用毛细管气相色谱获得了较为理想的鲜肿节风挥发油GC指纹图谱。

本研究拟借助SPME结合GC来测定20种不同茶油原料的挥发性成分数据，并以此来构建茶油挥发性成分的指纹图谱，以期为茶油的质量控制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试样及试剂

茶油20种，分别编号为S1～S20，S1～S6为实验室自榨，S7～S20为市售，具体信息见表1。菜籽油，市售；十二烷（Dodecane，44010-5 mL，纯度＞99.8%）、壬醛(442719-1G，纯度＞98%)、2-反己烯醛(132659-5G，纯度＞98%)均购自美国SIGMA-ALDRICH集团Fluka公司。

表1 茶油信息Table 1 The information of Camellia oil

1.2 仪器及设备

RCT basic型磁力加热搅拌装置，德国IKA仪器有限公司；CP224C型电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；SB-5200 DTDN型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；SPME手动进样手柄、 DVB/CA/PDMS (2 cm, 50/30 μm)纤维头、15 mL带有PTFE/硅橡胶瓶垫的透明样品瓶，美国Supelco公司；GC-2014型气相色谱仪，日本岛津公司。

1.3 茶油挥发性成分的顶空固相微萃取（SPME）

称取0.2 g茶油油样及0.01g内标溶液（浓度为0.033 05 mg/g的十二烷油溶液，33.05 mg的十二烷溶于1 000 g的精炼茶油）放入15 mL透明样品瓶中。将磁力加热搅拌装置调至90℃，待温度稳定后，将SPME针管穿过样品瓶的硅橡胶瓶垫，伸出纤维头，顶空萃取10 min。待气相色谱仪处于准备状态后，将SPME迅速穿过进样口硅胶隔垫，伸出纤维头解析10 min。SPME纤维头在下次萃取前应在进样口200 ℃下洗脱10 min以上。

1.4 气相色谱仪（GC）分析条件

采用美国supelco公司Capillary Column色谱柱（60 m×0.25 mm×0.2 μm）：氢火焰离子化检测器（FID）；进样口温度为200℃；检测器温度为250 ℃；进样量为1 μL；以氮气为载气：以氢气为燃气；以无油空气为助燃气；色谱柱升温采用程序升温，起始柱温为40 ℃（保持2 min），以3℃/min的升温速度升至160℃后保持2 min，继续以12 ℃/min的升温速度升至220℃保持5 min。

2 结果与分析

2.1 茶油挥发性成分指纹图谱的构建

不同纬度分布的油茶籽出油率存在一定差异，所得茶油脂肪酸含量也不同[15]。茶油产地、制备工艺、贮藏环境等条件的差异均会导致其挥发性成分的复杂多样，因而要建立能准确反映茶油挥发性成分的指纹图谱的关键在于特征指标类型的选定[16]。本研究以来源不同的20种茶油样品为原料，采用SPME获得其挥发性成分，并借助GC进行检测（在1.4条件下）。在对色谱峰数据进行分析时，先是去除峰面积过低（浓度较小）和保留时间长于54 min的峰（此类峰一般为高沸点化合物），然后从该定向图谱中筛选出匹配数大于10的17个共有色谱峰，以此建立茶油挥发性成分的指纹图谱，结果见图1。

图1 不同样品茶油挥发性成分的GC指纹图谱Fig. 1 The GCfingerprint of volatile components of different Camellia oil samples

在分析过程中，发现同一物质即使在同样的GC检测分析条件下，其色谱图仍会出现保留时间漂移、响应值变迁等现象，这将极大程度地降低所建立茶油挥发性成分指纹图谱的准确性。为解决此问题，本试验选定十二烷为内标添加参考物，分别计算各共有峰的相对保留时间和相对保留面积，从而对其进行定性和定量分析。同时，以共有峰中较为稳定的6号和8号（见图2）为对照，辅助定性各共有峰。该图谱具有专属性强、重复性好的特点，能够较好地反映各茶油挥发性成分特征。

2.2 茶油挥发性成分指纹图谱建立方法的验证

对试验2.1所建的茶油挥发性成分指纹图谱方法分别进行精密度、重复性和样品稳定性实验，以验证其准确性。取茶油样品（S1），进行挥发性成分固相微萃取，按照1.4色谱条件重复进样5次，其色谱图中各共有指纹峰相对保留时间的RSD为0.21%～0.36%，相对峰面积的RSD为0.87%～3.47%，均小于5.0%，符合指纹图谱制订的相关要求；取茶油样品（S1）5份，进行挥发性成分固相微萃取，按1.4色谱条件进样分析，其色谱图中各共有指纹峰相对峰面积的RSD为0.16%～0.52%，相对峰面积的RSD为1.56%～4.26%，均小于5.0%，符合指纹图谱制订的相关要求；取茶油样品（S1）6份，与内标溶液一起加入到透明样品瓶中，于室温下放置，分别进行0、2、4、8、12、24 h不同时间的挥发性成分固相微萃取，按1.4色谱条件进样分析，各共有指纹峰与参比峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于4.0%，符合指纹图谱制订的相关要求。综上所述，所建立的指纹图谱方法能准确地应用于茶油挥发性成分的鉴别。

图2 各批次茶油挥发性成分GC共有峰色谱图Fig. 2 The GC chromatogram of volatile components common peak of camellia oil samples

2.3 不同产地茶油挥发性成分的聚类分析

对检测到的20个不同茶油样品的挥发性成分数据，采用夹角余弦作为测度，按组间联接分析法对其进行聚类分析，结果以树状图表示（见图3）。

由图3可知，样品（S2）和样品（S6）、样品（S11）和样品（S12）在聚类重新标定距离约为2的最小水平上形成两个聚类，这表明S2和S6、S11和S12有最大的相似性，进一步对样品进行分析发现：S2和S6的茶油种子均来自于广西博白，而S11和S12均为冷榨的精炼成品油，可见不同的茶油原料和制备工艺均会对其的挥发性成分产生影响；随着聚类重新标定距离的逐渐变大，其他样品也随之并入到不同的类别中，当聚类重新标定距离为25时，全部样品的挥发性成分数据可并为一类，聚类重新标定距离的最大值和最小值相差了接近23，可见所选的20个样品间的挥发性成分差异较大，样品具有一定的代表性，需要较大的聚类重新标定距离才能将其聚为一类，这也从一定程度上说明所建立的茶油挥发性指纹图谱有较广的应用范围；当聚类重新标定距离接近20时，仍可聚为4类，其中样品（S1）和样品（S18）、样品（S14）和样品（S17）及样品（S10）和样品（S16）分别聚为3类，其余14个样品聚为同一类，可见要建立一个准确度较高的挥发性指纹图谱需要尽可能保证所选茶油原料的一致性。

2.4 茶油挥发性成分相似度评价

相似度是国家药典委员会确定的中药指纹图谱标准中的一项重要评价指标，适用于分析挥发性成分复杂多样的茶油样品[17]。本研究以2.1茶油挥发性成分指纹图谱的构建数据为基础，采用样本间夹角余弦来计算相似度，结果见表2。

图3 20批次茶油样品聚类分析树状图Fig. 3 The cluster analysis tree of 20 Camellia oil samples

表2 20个不同茶油样品的相似度Table 2 The similarity of 20 Camellia oil samples

由表2可知，样品S7、S8和S19、S20的相似度均大于0.9，说明其指纹图谱具有较高的相似性。进一步分析发现，S7、S8和S19、S20均为采用热榨法制备，该工艺使得一部分样品的成分挥发，产生额外的香气；样品S1～S6、S11～S13、S18的相似度在0.7～0.9之间，这些样品除S18外，其余均采用冷榨法制备。同时，除S12、S13、S18外，其余均为毛油。这说明，制油方法是否精炼均会对茶油挥发性成分的保留产生一定的影响；其余样品相似度在0.7以下。这一结果提示，20个茶油样品中因产地、加工方法、储存方法、储存时间有所不同，挥发性成分的组成、比例和数量也具有差异，其中加工方法起主要作用，这为茶油的规范化生产提供了一定的理论基础。

2.5 菜籽油—茶油的掺伪定量检测

为了避免不同茶油原料对结果的干扰，选定其中一种茶油作为菜籽油-茶油掺伪模型的研究基础。对9份菜籽油-茶油掺伪样品的挥发性成分气相色谱图数据进行直观分析与特征色谱峰分析。由于上述特征色谱峰峰面积均呈线性变化，因而选取色谱峰面积大于5%的色谱峰峰面积作为向量计算夹角余弦。利用公式来计算各掺假茶油对纯茶油的相似度，结果见表3。

表3 茶油掺菜籽油挥发性成分指纹图谱相似度与相对误差Table 3 The camellia oil mixed with canola oil volatile components fingerprint similarity and relative error

由表3可知，掺假量越多，指纹图谱相似度越小，二者呈线性递减曲线，线性方程式可拟和为Y=-4 572.5X3+5 637.4X2-2 206.3X+364.05（Y为菜籽油掺假比例%，X为夹角余弦cosθ）。通过线性方程式计算掺假量，与实际掺假量进行比较，并计算相对误差，相对误差平均值为4.49%；掺假量在25%～100%范围内的相对误差平均值为3.32%，且该掺假范围内的检测相对误差均小于10%。这从一定程度上说明，掺假量越大，相对误差越小。因而，该模型可用于检验茶油掺假菜籽油的比例（以25%～100%为宜），以维护消费者权益。

3 结 论

采用SPME-GC建立了20种不同茶油的挥发性成分指纹图谱，该图谱具有专属性强、重复性好的特征，可用于茶油质量评价鉴定。通过聚类分析，发现当聚类重新标定距离达到约25时，才能够将所有样品聚为一类，表明所选茶油样品挥发性成分差异较大，具有一定的代表性，应用范围较广。相似度分析结果表明，20个茶油样品中相似度大于0.9的样品有4个，相似度在0.7～0.9之间的样品有10个，其余6个样品相似度均低于0.7，该结果进一步说明油茶的产地、储存时间，尤其是加工方法会影响其挥发性成分的组分。因此，生产规范化是保证茶油质量的关键。研究茶油-菜籽油掺伪模型挥发性成分并利用指纹图谱计算其相似度，建立了菜籽油-茶油掺伪模型：Y= -4 572.5X3+5 637.4X2-2 206.3X+364.05（Y为 菜籽油掺假比例%，X为夹角余弦cosθ），适用于检验菜籽油掺伪量25%以上的茶油。

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[本文编校：谢荣秀]

Detection method research on adulteration ofCamelliaseed oil based onfingerprint of volatile components

ZHOU Bo1,2,3, SUN Yajuan1,2,3, WANG Jinying1,2,3, JIN Chao1,2,3, ZHONG Haiyan1,2,3
(1.College of Food Sciences and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China;2. Hunan Province Key Laboratory of Grain, Oil Processing and Quality Control, Changsha 410004, Hunan, China;3. Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees of Education Ministry, Changsha 410004, Hunan, China)

To build afingerprint based on volatile component forCamelliaseed oil adulteration detection in this paper, 20 kinds of differentCamelliaseed oil were used as material to analysis volatile components by headspace solid phase microextraction (SPME)and GC. The results showed that theCamelliaseed oilfingerprint of volatile component was consists of 17 common chromatographic peaks including nonanal and trans-2-hexenal etc., which is strongly effected by the producing area, storage time, especially the preparation technology according to the similarity and cluster analysis; Choosing one kind of camellia oils as the study object, we built the adulteration model for rapeseed oil,Camelliaseed oil which is that:Y=-4 572.5X3+5 637.4X2-2 206.3X+364.05 (Yfor rapeseed oil adulteration ratio %,Xfor the included Angle cosine cosine theta), and this can be applied to the identification of more than 25% of the amount of adulteration camellia oil.

Camelliaseed oil; volatile profiles;fingerprint; Adulteration model

S789；TS229

A

1673-923X(2017)09-0118-06

10.14067/j.cnki.1673-923x.2017.09.020

2016-03-10

湖南省科技计划农林领域重点开发项目（2016NK2145）；湖南省林业厅项目（XLB201618）

周 波，副教授，博士；E-mail：zhbo78@126.com

周 波，孙亚娟，王进英，等.茶油挥发性成分指纹图谱的构建及掺伪定量检测方法研究[J].中南林业科技大学学报，2017,37(9): 118-123.