不同处理对国槐硬枝扦插生根的影响及生根过程中相关氧化酶活性的变化

王艳晶，彭祚登

（北京林业大学 林学院，北京 100083）

不同处理对国槐硬枝扦插生根的影响及生根过程中相关氧化酶活性的变化

王艳晶，彭祚登

（北京林业大学 林学院，北京 100083）

以8年生国槐的当年生枝条为材料，研究了基质、生长素种类和质量浓度对硬枝扦插生根的影响，分析了在生根过程中吲哚乙酸氧化酶（IAAO）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的活性变化。结果表明：（1）河沙中插穗的生根率和生根指数分别为74.33%和23.09，综合生根效果显著优于珍珠岩+蛭石（1∶1）与草炭+珍珠岩+蛭石（1∶1∶1）2种混合基质。（2）外源生长素处理可显著提高插穗生根率，且NAA处理效果优于IBA和ABT1处理；其中NAA 500 mg/L处理的插穗生根率最高，达到78.67%，比对照提高了53.34%。（3）国槐在硬枝扦插生根过程中，可分为诱导期、表达期和伸长期3个阶段。IAAO活性在诱导期迅速上升，表达期下降，伸长期急剧下降；POD活性在诱导期迅速上升，表达期下降，在第20天有一处高峰；PPO活性在诱导期呈上升趋势，表达期和伸长期下降。

国槐；硬枝扦插；繁殖技术；氧化酶

国槐Sophora japonica作为我国北京、西安、太原等多个城市的市树[1]，其树形优美，寿命极长，抗性强，落叶较晚，材质优良，在防风固沙、改善环境以及药用等方面发挥着重要的作用，是城乡绿化的主要乡土树种之一[2]。目前，国槐育苗在生产上主要采用种子繁殖[3]。由于实生繁殖后代易产生性状变异，制约了良种优良性状的多代保持。扦插在传统无性繁殖中应用前景最广[4]，通过扦插繁殖，后代能保持母株的优良性状。国槐扦插生根困难[5]，已报道国槐硬枝扦插时间在春季和秋季均可，直插与斜插对国槐扦插成活率及生长量无明显影响[3]，有关较为全面系统研究国槐扦插生根未见报道。因此，开展国槐扦插繁殖研究显得十分重要。

吲哚乙酸氧化酶(IAAO)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)是植物体内重要的生根关联酶，这3种酶与植物不定根的发生和生长有着密切关系[6]。IAAO能降解内源IAA，通过调节植物体内IAA水平，影响植物的生长发育[7]。POD活性的高低可作为生根标志之一[8]。PPO能催化酚类物质与IAA形成一种“IAA-酚酸复合物”[9]，这种复合物是一种生根辅助因子，可以促进不定根的形成[10]。本研究初步探讨了基质和外源生长素对国槐硬枝扦插生根的影响，分析了NAA处理对IAAO、POD和PPO活性的作用效果及3种酶与扦插生根的关系，为揭示国槐硬枝扦插生根机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 插穗采集、贮藏与制穗

供试材料采自北京林业大学八家实验苗圃内8年生国槐。于2015年12月剪取国槐生长健壮、无病虫害和机械损伤的当年生硬枝，冷库低温沙藏，沙的湿度以手握成团但不滴水（约为饱和含水量的60%）为宜。试验于2016年3月进行，制穗长度为15～20 cm，上切口距第一个芽0.5～1.0 cm，平切，下切口紧贴基部芽，斜切，切口均需平滑。

1.2 试验设计

试验分为基质种类及生长素种类和质量浓度两部分。基质种类试验采用生长素IBA300 mg/L＋NAA300 mg/L处理插条基部3 h，基质分别为河沙、珍珠岩+蛭石（体积比为1∶1）和草炭+珍珠岩+蛭石（体积比为1∶1∶1）；生长素种类和质量浓度效应试验以河沙为扦插基质，选用IBA、α-NAA和ABT1这3种激素，质量浓度分别为0、300、500和1 000 mg/L，处理时间为3 h。以上试验均采用完全随机区组设计，每个处理30条，重复3次，扦插深度为10～15 cm。扦插后，每隔7 d分别喷洒质量百分比为0.1%的高锰酸钾溶液和50%多菌灵可湿性粉剂500倍液进行交替消毒。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生根指标

扦插后每隔5 d进行一次插条形态和解剖学观察，观察并记录愈伤组织出现期和不定根出现期。于第35天进行生根指标调查，包括生根类型、生根株数、生根插条的平均生根数及平均根长。牟洪香[11]指出生根指数（rooting index）是一个能够较好表达诱导生根效果的综合指标，其意义是指单株扦插苗的平均总根长（cm）。用公式表示：RI=R×N×L。其中，R为生根率，N为平均根数，L为平均根长。以生根率对生根指数贡献最大，平均根数次之，平均根长最次。

1.3.2 酶活性的测定

供酶活性测定的插穗采用NAA500 mg/L处理3 h。扦插后，每隔5 d取样一次，每个重复随机抽取 10～12根插穗。剥取穗条基部 2～3 cm韧皮部，剪碎混匀，经液氮速冻处理后，保存于-80 ℃的超低温冰箱中。POD活性测定与计算参考李合生等[12]的方法，于470 nm下测定5 min内吸光度值的变化。参照郝建军等[13]的方法测定PPO活性，在410 nm下测定吸光度。IAAO活性测定参照高俊凤等[14]的方法，530 nm下测定吸光度，活性以每g鲜质量在1 h内破坏IAA的量（μg）表示。

1.4 数据分析

试验数据采用SPSS 16.0和LSD多重比较进行统计分析（生根率数据开方后取反正弦，再进行方差分析）。

2 结果与分析

2.1 硬枝插条生根形态变化

研究发现，经NAA处理的插穗扦插15 d后在切口处出现愈伤组织，第20天愈伤组织处生出不定根。对照插穗20 d后发生愈伤组织，30 d后，仅少数插穗产生不定根。第35天进行生根指标全面调查，NAA处理的插穗生根率最高可达78.67%；生根插穗不定根根数范围为1～6条，平均根数为5条；不定根根长范围为1.2～7.0 cm，平均根长为6.3 cm。从生根部位看，生根插穗都为愈伤组织生根，因此国槐硬枝扦插生根类型为愈伤组织生根。

不定根的形成可分为诱导期、表达期和伸长期[15]。据此，国槐插穗扦插后0～20 d为诱导期，20～30 d为表达期，30 d后为伸长期。

2.2 不同因素对国槐硬枝扦插生根的影响

2.2.1 扦插基质对插穗生根的影响

从表1可看出，相同外源激素IBA＋NAA处理下，3种基质间插穗生根率差异极显著（P＜0.01），河沙中的插穗生根率最高，为74.33%，与其它2种混合基质差异极显著，混合基质珍珠岩+蛭石的生根率为47.67%，显著高于草炭+珍珠岩+蛭石的生根率。河沙和草炭+珍珠岩+蛭石中插穗平均根数最多，为4条，珍珠岩+蛭石中最少。河沙中平均根长最长，为5.54 cm，其次为草炭+珍珠岩+蛭石、珍珠岩+蛭石。可知，不同基质间生根指数差异显著（P＜0.05），3种基质生根指数变异幅度为11.72～23.09，河沙中的插穗生根指数最大，为23.09，与其它2种混合基质差异显著，混合基质珍珠岩+蛭石和草炭+珍珠岩+蛭石中的插穗生根指数差异不显著。因此，从生根综合效果考虑，国槐硬枝扦插以河沙为基质最好。

表1 扦插基质对国槐硬枝扦插生根的影响†Table 1 Effect of cutting media on the rooting of hardwood cutting of S. japonica

2.2.2 生长素处理对插穗生根影响

由表2可以看出，经不同浓度的 IBA、NAA和ABT1处理的插穗，生根率、平均根数、平均根长和生根指数均存在显著差异（P＜0.05）。在IBA和NAA处理下，插穗各生根指标均呈先上升后下降的趋势，且都在质量浓度为500 mg/L时达到峰值；ABT1处理的插条在300 mg/L时各指标达到最大值。其中，未经外源生长素处理的插穗（CK），生根率较低，平均根数较少，平均根长较短，生根效果差。在IBA500 mg/L处理下，生根率、平均根长和生根指数分别为59%、4.84 cm和16.65，显著高于其他处理；NAA500 mg/L处理下，根长和生根指数分别为6.33 cm和34.43，显著高于其它处理，其中生根率高达78.67%，比对照提高了53.34%；ABT1为300 mg/L时，根长和生根指数为5.02 cm和15.34，显著高于其它处理。据此，在国槐硬枝扦插时，中等质量浓度的IBA和NAA处理插穗能促进其生根，而在ABT1处理下，则宜选用较低质量浓度。

表2 生长素对国槐硬枝扦插生根的影响Table 2 Effects of auxin on the rooting of hardwood cutting of S. japonica

由表3可知，3种生长素处理间平均生根指数差异极显著（P＜0.01）。NAA处理的插穗平均生根指数最大，为22.34，与其它2种生长素差异显著，IBA和ABT1处理的插穗平均生根指数差异不显著。ABT1处理的平均生根指数最小，只有9.82。综上，外源生长素NAA处理插穗基部的生根综合效果最好。

表3 IBA, NAA和ABT1处理下国槐插条生根指数及LSD多重比较†Table 3 The stem rooting index of S. japonica treated with IBA, NAA and ABT1 and its multiple comparison analysis

2.3 NAA处理插穗生根过程中3种氧化酶活性的变化

2.3.1 吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性

由图1可以看出， IAAO活性随扦插生根时期的推进呈规律性变化。处理组插穗IAAO活性在扦插0～20 d急剧上升，达到最高峰，随后在小幅波动中下降，30 d后又急剧下降；对照插穗在扦插0～25 d上升缓慢，到达峰值，25～35 d持续降低。在整个生根进程中，处理组插穗IAAO活性始终高于同期对照插穗。方差分析结果表明，不同扦插时期的IAAO活性差异达到极显著水平（P＜0.01），说明IAAO活性变化与国槐硬枝扦插生根关系十分密切；处理与对照插穗IAAO活性水平差异显著（P＜0.05），说明NAA处理对IAAO活性影响的效果明显。

图1 国槐硬枝扦插生根过程中IAAO活性变化Fig.1 Changes of IAAO activity in S. japonica during hardwood-cutting rooting process

2.3.2 过氧化物酶（POD）活性

由图2可知，国槐插穗生根过程中，POD活性随扦插天数的不同呈规律性的变化。处理组和对照插穗体内POD活性都呈“上升-下降-上升”的变化趋势，且都在第20天达到峰值。在生根进程中，处理组插穗POD活性始终高于同期对照插穗，其中，处理组插穗POD活性在诱导期逐渐上升至最大值，比扦插起始时期活性增加了147.6%，而对照仅增加了81.39%。方差分析结果显示，不同生根时期的POD活性差异显著（P＜0.05），说明POD活性变化与国槐硬枝插穗生根有密切的联系；处理组和对照插穗POD活性差异极显著（P＜0.01），说明NAA处理对POD活性的影响效果明显。

图2 国槐硬枝扦插生根过程中POD活性变化Fig.2 Changes of POD activity in S. japonica during hardwood-cutting rooting process

2.3.3 多酚氧化酶（PPO）活性

图3 国槐硬枝扦插生根过程中PPO活性变化Fig.3 Changes of PPO activity in S. japonica during hardwood-cutting rooting process

从图3可以看出，处理组插穗PPO活性0～20 d持续上升，达到峰值，然后迅速降低，25～30 d有小幅上升，30～35 d又缓慢下降；对照组插穗PPO活性呈现先上升后下降的变化趋势，在第25天达到最大值。可见，PPO活性随扦插生根时期的不同呈规律性变化。处理和对照都明显提高了插穗PPO活性，但对照出现峰值的时期晚于处理，且对照插穗在35 d时PPO活性恢复到了起始时期较低水平。方差分析结果显示，在整个生根过程中，不同时期的PPO活性差异极显著，说明PPO活性变化与国槐硬枝插穗生根具有十分密切的关系；但处理组与对照插穗PPO活性差异不显著，说明NAA处理对PPO活性影响效果不明显。

3 结论与讨论

3.1 基质和外源生长素与国槐硬枝扦插生根的关系

研究表明，国槐硬枝扦插生根类型为愈伤组织生根，这与石进朝[3]的结论一致。基质的组成与物理性质决定着插穗的生根环境，理想的扦插基质应具有最佳孔隙度以满足气体交换[16]，同时应具备适宜的水分和养分储备以满足插穗的根系发育[17]。扈红军等[18]发现，河沙不利于欧榛硬枝扦插生根。但也有研究发现，河沙通气，排水性好，可显著降低插穗腐烂率，提高生根率[19]。试验条件下，以河沙作为基质对国槐硬枝扦插生根的综合效果最佳，支持了后者的结论。

外源激素处理不仅可以加快插穗基部细胞分裂和生长的速度，而且可以促进营养物质流向基部，从而有利于根原基的形成[20]。目前，广泛用于促进插穗扦插生根的外源生长素有吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)，以及商业化的生根促进剂，其中以IBA效果最为突出[21-22]。但孟新法等[23]和汪仁等[24]认为，NAA在促进植物插条生根方面效果最好。王小玲等[25]在四倍体刺槐硬枝扦插试验中发现，在应用外源生长素促进生根时，要严格控制质量浓度，使其保持在适宜水平。本研究结果同样说明适宜的生长素质量浓度有利于促进国槐硬枝插条生根，且NAA处理综合效果优于IBA 和ABT1处理。初步确定，以NAA 500 mg/L处理插条为最佳，生根效果最好，生根指数最大，生根率高达78.67%。

3.2 国槐硬枝扦插生根与氧化酶活性的关系

吲哚乙酸氧化酶（IAAO）的重要作用是氧化IAA，而IAA的一个生理效应是调节愈伤组织的形态建成以及促进不定根的形成。因此，IAAO可以通过调节IAA的含量，从而影响不定根的发生和发育等生理过程。Wiesman等[26]认为，在根的诱导期，IAAO活性较低，IAAO通过调节IAA水平，从而促进不定根的生长。相反，Gaspar等[8]和宋金耀等[27]试验研究表明，离体生根过程中，在根的诱导期，IAAO活性升高，使内源IAA水平降低，低质量浓度的IAA有利于生根。随后，在根的表达期，IAAO活性降低，较高水平的IAA可促进根的生长。但Nag等[28]研究表明，在根的表达期，较高活性的IAAO有利于根的伸长。本试验结果表明，国槐硬枝插穗在生根的诱导期IAAO活性升高，到达峰值，之后IAAO活性下降，总的变化趋势与Gaspar等[8]和宋金耀等[27]的研究结论一致，与Wiesman等[26]和Nag等[28]的试验结论相反。

过氧化物酶（POD）不仅参与植物的氧化胁迫过程，而且它还在植物体内的多种生理生化反应中发挥重要作用。Moncousin等[29]和宋金耀等[27]研究发现，在不定根的诱导期和表达期，POD活性会出现两个高峰，POD作用的某些产物可能是不定根发生和发展所必须的辅助因子，促进不定根的形成。而扈红军等[30]研究发现，榛子在扦插生根过程中仅有一个高峰。这说明POD活性对插穗生根的影响可能因物种不同而异。本研究表明，处理和对照插穗POD活性均在诱导期上升，氧化体内过多的内源IAA，促进根原基发育；之后在表达期下降，使内源IAA水平升高，有利于根的表达，期间出现一个高峰。

多酚氧化酶（PPO）是广泛分布于植物体中的一种铜结合酶，对不定根的形成起到重要作用。李明等[31]在桉树扦插试验中发现，难生根品种体内的PPO活性较低，不利于不定根的发生。本研究中，在根的诱导期，随着扦插时间的推进，插穗体内PPO活性持续上升，催化生成的“IAA-酚酸复合物”相应增多，促进了愈伤组织的生成及不定根的形成，这与王瑞等[32]对油茶的研究结论一致。而对照插穗在整个生根阶段PPO活性都较低，生成的“IAA-酚酸复合物”较少，不利于生根。

综上所述，国槐硬枝扦插生根与IAAO、POD、PPO活性密切相关。在整个扦插生根过程中，IAAO、POD和PPO活性呈规律性变化，总体趋势为在根的诱导期，3种氧化酶活性上升，之后不同程度地降低。另外，处理插穗的POD、IAAO活性均显著高于对照，说明处理对POD、IAAO活性影响明显，因此，NAA处理显著提高了插穗的生根率，可能与POD、IAAO活性增加有密切关系。

[1]王照平. 河南适生树种栽培技术[M]. 郑州: 黄河水利出版社,2009: 121-125.

[2]王玉芳, 王泽平. 国槐的价值及育苗栽培技术[J]. 现代农业科技, 2016(8): 163-163.

[3]石进朝. 国槐扦插繁殖试验研究[J]. 林业科技开发, 2001,15(2):21-23.

[4]郭素娟. 林木扦插生根的解剖学及生理学研究进展[J]. 北京林业大学学报, 1997, 19(4):64-69.

[5]赵 燕. 国槐分类学与繁殖特性研究[D]. 济南: 山东师范大学, 2007: 9-14.

[6]Cao B H. Rooting Capacity and Correlative Enzymes Activities of Hardwood Cuttings of Mulberry[J]. Science of Sericulture,2008, 34(1): 96-100.

[7]Devi S R, Prasad M N V. Ferulic acid mediated changes in oxidative enzymes of maize seedlings: implications in growth[J].Biologia Plantarum, 1996, 38(3): 387-395.

[8]Gaspar T, Kevers C, Hausman J F,et al. Practical uses of peroxidase activity as a predictive marker of rooting performance of micropropagated shoots[J]. Agronomie, 1992, 12(10): 757-765.

[9]Haissig B E. Influences of auxins and suxin synergists on adventitious root primordium initiation and development[J]. New Zealand Journal of Forestry Science, 1973, 4: 311-323.

[10]Bassuk N L, Hunter L D, Howard B H. The apparent involvement of polyphenol oxidase and phloridzin in the production of apple rooting cofactors[J]. Journal of Horticultural Science, 1981,56(4): 313-322.

[11]牟洪香. 三倍体毛白杨优良无性系微体快速繁殖技术研究[D].济南: 山东农业大学, 2003.

[12]李合生. 植物生理生化实验原理和技术[M]. 北京: 高等教育出版社, 1999.

[13]郝建军, 康宗利, 于 洋. 植物生理学实验技术[M]. 北京: 化学工业出版社, 2007.

[14]高俊凤. 植物生理学实验指导[M]. 北京: 高等教育出版社,2006.

[15]Hausman J F, Evers D, Kevers C,et al.Internal controls of root induction in poplar shoots raised in vitro. J Appl Bot[J].Angewandte Botanik, 1997.

[16]Amri E. The effect of auxins (IBA, NAA) on vegetative propagation of medicinal plantBobgunnia madagascariensis(Desv.) J. H. Kirkbr & Wiersema[J]. Tanzania Journal of Natural and Applied Sciences, 2011, 2(2): 359-366.

[17]Ercişli S, Anapali Ö, Eşitken A,et al.The Effects of IBA, rooting media and cutting collection time on rooting of kiwifruit [J].European Journal of Horticultural Science, 2002, 67(1): 34-38.

[18]扈红军, 曹帮华, 尹伟伦,等. 不同处理对欧榛硬枝扦插生根的影响及生根过程中相关氧化酶活性的变化[J]. 林业科学,2007, 43(12):70-75.

[19]王书胜, 单 文, 张乐华,等. 基质和IBA浓度对云锦杜鹃扦插生根的影响[J]. 林业科学, 2015, 51(9): 165-172.

[20]曾晶珏, 张 成, 李志辉,等. 不同生根剂及处理枝条方式对钩栗扦插生根的影响[J]. 中南林业科技大学学报, 2016,36(6): 56-60.

[21]孙晓梅, 赵海祥, 宁延龙,等. 不同生长素处理条件下杂种落叶松生根力的变异[J]. 林业科学, 2009, 45(9): 142-146.

[22]李金镕, 刘卫东, 程宇飞,等. 观赏桃嫩枝扦插技术研究[J].经济林研究, 2016, 34(2):152-157.

[23]孟新法, 周维燕. 吲哚丁酸对苹果矮化砧离体快速生根的影响[J]. 中国农业大学学报, 1982, 13(2): 25-28.

[24]汪 仁, 孟祥静, 何丽斯,等. 双瓣茉莉扦插繁殖技术研究[J].江苏农业科学, 2011, 39(5): 260-262.

[25]王小玲, 赵 忠, 权金娥,等. 外源激素对四倍体刺槐硬枝扦插生根及其关联酶活性的影响[J]. 西北植物学报, 2011,31(1): 116-122.

[26]Wiesman Z, Riov J, Epstein E. Comparison of movement and metabolism of indole-3-acetic acid and indole-3-butyric acid in mung bean cuttings[J]. Physiologia Plantarum, 1988,74(3):556-560.

[27]宋金耀, 何文林, 李松波,等. 毛白杨嵌合体扦插生根相关理化特性分析[J]. 林业科学, 2001, 37(5): 64-67.

[28]Nag S, Saha K, Choudhuri M A. Role of Auxin and Polyamines in Adventitious Root Formation in Relation to Changes in Compounds Involved in Rooting[J]. Journal of Plant Growth Regulation, 2001, 20(2): 182-194.

[29]Moncousin C H, Gaspar T H. Peroxidase as a Marker for Rooting Improvement ofCynara scolymusL. Cultured in vitro 1[J].Biochemie Und Physiologie Der Pflanzen, 1983,178(4):263-271.

[30]扈红军, 曹帮华, 尹伟伦,等. 榛子嫩枝扦插生根相关氧化酶活性变化及繁殖技术[J]. 林业科学, 2008, 44(6): 60-65.

[31]李 明, 黄卓烈, 谭绍满, 等. 吲哚乙酸处理桉树插条后氧化酶活性及同工酶变化与生根关系的比较研究[J]. 林业科学研究, 2001, 14(2): 131-140.

[32]王 瑞, 陈永忠, 王湘南,等. 油茶组培苗生根过程中生理生化指标的变化[J]. 经济林研究, 2015, 33(2):68-72.

[本文编校：谢荣秀]

Effects of different treatments on hardwood-cutting rooting and related oxidase activity changes during rooting ofSophora japonica

WANG Yanjing, PENG Zuodeng
(College of Forestry, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

Annual stiff branches of 8-year-oldSophora japonicawere taken as materials in this experiment. The effects of media, kinds of auxin and concentration of hardwood cuttings were studied, and the changes of IAAO, POD and PPO activities were explored during their rooting process. The results showed:(1) Rooting percentage of cutting was 74.33% and rooting index was 23.09 by river sand,which treatment was better than Perlite+ Vermiculite (1∶1) medium and Turf+ Perlite+ Vermiculite (1∶1∶1) medium. (2) Suitable exogenous auxin treatment had an obvious effect on accelerating rooting. The cuttings treated with 500 mg/L of NAA showed the highest rooting rate (78.67%), which was 53.34% higher than the cuttings of control. (3) The adventitious rooting displayed three distinct phases i.e. induction, expression and elongation. Indoleacetic acid oxidase activity of NAA-treated cuttings increased rapidly in the induction phase and then decreased in the expression and elongation phases. The peroxidase activity in NAA-treated cuttings increased rapidly during induction phases and declined during expression phases. There was one peak of the POD activity on the 20th during rooting. Polyphenol oxidase activity in NAA-treated cuttings increased during induction phase, however declined during expression and elongation phases.

Sophora japonica; hardwood cutting; propagation technique; oxidases

S723.1+32.1

A

1673-923X(2017)09-0074-06

10.14067/j.cnki.1673-923x.2017.09.013

2016-12-14

北京市园林绿化局科技创新项目“北京园林绿化落叶乔木优良品种选育及栽培技术”（CEG-2015-01）

王艳晶，硕士研究生

彭祚登，副教授，博士；E-mail:zuodeng@sina.com

王艳晶，彭祚登. 不同处理对国槐硬枝扦插生根的影响及生根过程中相关氧化酶活性的变化[J].中南林业科技大学学报，2017, 37(9): 74-79.