曲安奈德皮损内注射对兔耳创面瘢痕形成影响的实验研究

李晓慧 陈宝霞 申勇智 王丽坤 孙雪峰

·论著·

曲安奈德皮损内注射对兔耳创面瘢痕形成影响的实验研究

李晓慧 陈宝霞 申勇智 王丽坤 孙雪峰

目的观察曲安奈德皮损内注射对兔耳创面瘢痕形成的影响，并探讨其抑制瘢痕增生的分子机制。方法40只新西兰兔随机分为对照组和实验组，每组20只，均通过制作1 cm×1 cm大小的圆形创面构建兔耳增生性瘢痕模型。术后第28天形成创面瘢痕。对照组不给予任何处理，实验组于创面瘢痕块内注射100 μl曲安奈德，1次/周，共2次。术后第42天收集瘢痕组织。检测2组瘢痕厚度，成纤维细胞数量，胶原纤维密度，Ⅰ、Ⅲ型胶原含量，血管内皮生长因子(VEGF)，转化生长因子β1(TGF-β1)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，核因子κB(NF-κB)，炎性因子[白介素6(IL-6)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)]表达情况。结果实验组瘢痕厚度，成纤维细胞数量，胶原纤维密度，Ⅰ、Ⅲ型胶原比例，VEGF，TGF-β1，NF-κB，IL-6，TNF-α表达明显低于对照组，bFGF表达明显高于对照组，差异有统计学意义(Plt;0.05)。结论曲安奈德皮损内注射能够有效抑制兔耳增生性瘢痕形成，其机制与下调VEGF、TGF-β1表达、上调bFGF表达及抑制NF-κB炎症信号通路的过度激活有关。

增生性瘢痕；曲安奈德；成纤维细胞；胶原；核因子κB

增生性瘢痕是外伤或手术创面愈合过程中由于组织过度修复引起的皮肤病理性改变，其病理基础是成纤维细胞的过度增生和胶原蛋白的异常堆积[1-3]。目前，增生性瘢痕形成的病因尚不清楚，研究认为其与遗传、外伤、治疗等均有关[4,5]。因此，临床尚无针对增生性瘢痕的特异性治疗措施，手术切除、放射治疗、激光治疗、压迫疗法等方法虽然取得了一定疗效，但存在局部组织挛缩、易复发等不良反应[6-8]。曲安奈德是第一个用于防治瘢痕增生的类固醇类激素，已证实其具有抗炎、抑制纤维增生的作用。本研究在以上研究基础上，通过制作兔耳增生性瘢痕模型进一步观察曲安奈德对瘢痕增生的影响及可能分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性、健康新西兰大白兔40只，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2015-0001，体重2.0～2.5 kg。单笼单只饲养于通风、干燥环境中，适应性喂养7 d。

1.2 药品、仪器与试剂 曲安奈德购自浙江仙琚制药股份有限公司；Ⅰ、Ⅲ型胶原，VEGF，TGF-β1，bFGF多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；细胞裂解液，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Gibco-BRL公司；PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒购自日本Takara公司；Trizol，实时荧光定量试剂盒购自美国Promega公司。Chemi DocTM XRS+化学发光凝胶成像系统购自美国Biorad公司；7300型Real time-PCR扩增仪购自美国ABI公司；Vivid彩色多普勒超声诊断仪购自美国GE公司。

1.3 实验方法

1.3.1 兔耳瘢痕模型的构建及分组:40只动物随机分为对照组和实验组，每组20只。均构建兔耳增生性瘢痕模型。术前停止喂食，在耳背部剃去兔毛，术前经耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠麻醉，用穿孔器在兔耳腹侧打孔，剪开皮肤全层、皮下组织直至软骨膜，造成1 cm×1 cm大小的圆形创面。用无菌棉球止血后胶带固定，切口不予缝合，观察创面愈合及瘢痕形成情况。术后第28天形成创面瘢痕。对照组不给予任何处理，实验组于创面瘢痕块内注射100 μl曲安奈德，1次/周，共2次。术后第42天收集瘢痕组织。

1.3.2 彩色多普勒超声:采用彩色多普勒超声扫描测量兔耳瘢痕厚度。

1.3.3 HE染色:采用HE染色测定成纤维细胞数量、胶原纤维密度。在400倍光学显微镜下，选取HE染色组织切片标本中3个不同视野，观察并计数成纤维细胞数目，取均值。在200倍光学显微镜下，选取Masson染色的组织切片中3个不同视野，使用Image Pro-Plus 6.0图像分析软件计算2组光密度(IOD)值，即代表胶原纤维密度。

1.3.4 免疫组化SP法:采用免疫组化SP法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原含量及VEGF、TGF-β1、bFGF蛋白表达水平测定。Ⅰ、Ⅲ型胶原含量测定在20倍光学显微镜下，随机选择5个区域观察阳性染色密度，求均值。VEGF、TGF-β1、bFGF蛋白阳性表达判断标准：以胞浆和(或)胞核检出棕色或棕褐色颗粒即可判定为阳性染色。采用Motic Med 6.0图像分析系统对组织照片进行定量分析，在400倍光学显微镜下，随机选择5 个区域观察阳性染色密度，计数阳性细胞数。严格按照免疫组化试剂盒说明书进行操作。

1.3.5 Real time-PCR：Trizol提取组织总RNA，按照试剂盒说明书加样进行逆转录反应，ABI 7300型荧光定量PCR仪扩增。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用仪器自带的分析软件得到各样本、各基因扩增的Ct值，以GAPDH为内参照基因，目的基因表达相对值RQ=2-△△Ct。见表1。

表1 Real time-PCR引物序列及扩增产物长度

1.3.6 Western-blot:提取组织总蛋白，半干法电泳转移至PVDF膜，10%脱脂奶粉封闭2 h。依次加入特异性一抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，化学发光法显色、定影。用UVP软件扫描测定蛋白条带IOD值，GAPDH作为内参照，以目的蛋白与GAPDH吸光度值的比值表示目的蛋白相对表达水平。

1.4 观察指标 检测2组瘢痕厚度，成纤维细胞数量，胶原纤维密度，Ⅰ、Ⅲ型胶原比例，血管内皮生长因子(VEGF)，转化生长因子β1(TGF-β1)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，核因子κB(NF-κB)，炎性因子[白介素-6(IL-6)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]表达情况。

2 结果

2.1 2组瘢痕厚度比较 与对照组比较，实验组瘢痕厚度明显减少，差异有统计学意义(Plt;0.05)，说明曲安奈德能够明显抑瘢痕增生。见表2。

2.2 2组成纤维细胞数量、IOD值比较 与对照组比较，实验组成纤维细胞数量、IOD值明显减少，差异有统计学意义(Plt;0.05)，说明曲安奈德能够明显抑制成纤维细胞增殖和胶原纤维沉积。见表3。

组别瘢痕厚度对照组3.19±0.34实验组1.77±0.27*

注：与对照组比较,*Plt;0.05

组别成纤维细胞数量(个)IOD值对照组47.53±5.28486.22±76.09实验组10.34±1.43*122.31±25.84*

注：与对照组比较,*Plt;0.05

2.3 2组Ⅰ、Ⅲ型胶原含量比较 与对照组比较，实验组Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显升高，Ⅰ、Ⅲ型胶原比例明显降低，差异有统计学意义(Plt;0.05)，说明曲安奈德能够明显调控Ⅰ、Ⅲ型胶原合成，尤其Ⅲ型胶原的合成大幅增加。见表4。

组别Ⅰ型胶原含量(ng)Ⅲ型胶原含量(ng)Ⅰ/Ⅲ型胶原对照组11.51±1.1314.38±1.770.87±1.02实验组19.47±3.26*36.63±4.20*0.49±0.06*

注：与对照组比较,*Plt;0.05

2.4 2组瘢痕组织VEGF、TGF-β1、bFGF蛋白表达比较 与对照组比较，实验组瘢痕组织VEGF、TGF-β1蛋白表达明显降低，bFGF蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(Plt;0.05)，说明曲安奈德能够明显抑制VEGF、TGF-β1表达，促进EGF表达。见表5。

组别VEGF蛋白TGF-β1蛋白bFGF蛋白对照组2.57±0.312.88±0.341.12±0.14实验组0.99±0.11*1.06±0.17*2.79±0.31*

注：与对照组比较,*Plt;0.05

2.5 2组瘢痕组织NF-κB表达比较 与对照组比较，实验组瘢痕组织NF-κB mRNA和蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(Plt;0.05)，说明曲安奈德能够明显抑制瘢痕组织NF-κB表达。见表6。

组别NF-κBmRNA蛋白对照组2.60±0.312.49±0.27实验组1.12±0.23*1.05±0.18*

注：与对照组比较,*Plt;0.05

2.6 2组瘢痕组织炎性因子表达比较 与对照组比较，实验组瘢痕组织IL-6、TNF-α mRNA和蛋白表达明显降低(Plt;0.05)，说明曲安奈德能够明显抑制瘢痕组织炎性因子的过度释放。见表7。

3 讨论

增生性瘢痕是物理、化学、生物等因素引起的皮肤组织损伤后出现的成纤维细胞过度增殖、胶原过度合成和沉积及新生血管形成等，是多种细胞、细胞因子、细胞外基质成分相互作用的复杂过程[9]。创伤愈合修复过程中，成纤维细胞是发挥修复功能的主要细胞，然而在瘢痕形成等病理情况下成纤维细胞过度增殖、收缩并分泌大量细胞外基质，其中Ⅰ、Ⅲ型胶原是起皮肤支持作用的成分，二者含量在增生性瘢痕形成中均明显升高，且与瘢痕增生程度呈正比[10]。增生性瘢痕形成的标志就是Ⅰ、Ⅲ型胶原比例升高及胶原纤维排列紊乱。本研究结果表明，曲安奈德能够减轻瘢痕增生，作用后瘢痕组织成纤维细胞数量、胶原纤维密度及Ⅰ、Ⅲ型胶原比例明显低于对照组，提示曲安奈德具有抗瘢痕增生作用。

组别IL-6mRNA蛋白TNF-αmRNA蛋白对照组2.87±0.342.70±0.312.99±0.362.81±0.33实验组1.22±0.25*1.14±0.15*1.19±0.21*1.10±0.16*

注：与对照组比较,*Plt;0.05

TGF-β主要来源于血小板的细胞因子，具有促进细胞增殖、分化、胶原等细胞外基质合成与代谢等多种生物学功能。TGF-β包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三种异构体，其中TGF-β1在纤维化过程中发挥关键作用，参与了增生性瘢痕形成及发展的全程[11]。VEGF是目前已知作用最强的促血管生成因子，能够促进血管内皮细胞增殖、分化，并增加血管通透性，从而促进血管新生[12]。bFGF是FGF家族的重要成员，具有促进血管内皮细胞、成纤维细胞分化、增殖的作用，相反在创面愈合过程中bFGF能够刺激细胞外基质的代谢和合成，并促进成纤维细胞凋亡和抑制胶原合成[13]。本研究结果表明，曲安奈德作用后瘢痕组织TGF-β1、VEGF表达明显下调，bFGF表达明显上调，提示曲安奈德能够通过调控TGF-β1、VEGF、bFGF表达发挥抗瘢痕增生作用。

研究表明，炎性反应在增生性瘢痕形成中发挥重要作用。创伤愈合和瘢痕形成过程中创面出现的炎性瀑布反应可促进中性粒细胞、巨噬细胞等大量炎性细胞浸润，同时释放炎性因子，促进成纤维细胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原等细胞外基质的合成，从而导致病理性瘢痕形成[14]。NF-κB是介导免疫炎性反应的重要细胞因子，并参与细胞增殖、凋亡和纤维化等生理和病理过程[15]。研究发现，NF-κB信号通路的异常活化是增生性瘢痕发生的重要病理机制之一，与成纤维细胞过度增殖和凋亡能力减弱密切相关[16]。Makino等[17]报道使用NF-κB抑制剂DHMEQ能够明显抑制成纤维细胞增殖和I型胶原的合成和沉积，提示靶向抑制NF-κB可能减轻增生性瘢痕形成。本研究结果表明，曲安奈德作用后瘢痕组织NF-κB、IL-6、TNF-α表达明显降低，提示曲安奈德能够抑制NF-κB炎症信号通路的过度激活和炎性因子的释放，这可能是其发挥抗瘢痕增生作用的分子机制之一。

综上所述，曲安奈德皮损内注射能够有效抑制兔耳增生性瘢痕形成，其机制与调控VEGF、TGF-β1、bFGF表达、抑制NF-κB炎症信号通路的过度激活和炎性因子的过度释放，进而减少细胞外基质的合成和沉积、促进成纤维细胞凋亡有关。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.23.030

项目来源：河北省医学科学研究重点课题(编号：20150053)

075100 河北省张家口市，河北北方学院附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科(李晓慧、王丽坤、孙雪峰)，功能科(陈宝霞)；河北省张家口市宣化区人民医院耳鼻喉科(申勇智)

R 619.6

A

1002-7386(2017)23-3626-03

2017-08-20)