响应面法优化灵芝发酵培养基及发酵活性成分分析

孔祥辉，杨国力，高 洋，陈喜君，王 辉，马银鹏，陈 丹，陈 鹤，陈静宇

（1.黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江哈尔滨 150010；2.黑龙江省科学院高技术研究院，黑龙江哈尔滨 150001；3.黑龙江众生生物工程有限公司，黑龙江哈尔滨 150028；4.哈尔滨商业大学，黑龙江哈尔滨 150076）

响应面法优化灵芝发酵培养基及发酵活性成分分析

孔祥辉1，2，杨国力3，高 洋4，*陈喜君3，王 辉3，马银鹏1，陈 丹3，陈 鹤1，陈静宇1

（1.黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江哈尔滨 150010；2.黑龙江省科学院高技术研究院，黑龙江哈尔滨 150001；3.黑龙江众生生物工程有限公司，黑龙江哈尔滨 150028；4.哈尔滨商业大学，黑龙江哈尔滨 150076）

以灵芝液体发酵菌丝量和胞外多糖含量为评价指标，确定灵芝菌液体发酵最优培养基配方，分析了菌丝体和发酵液中的活性成分。结果表明，灵芝液体发酵最优配方为黄豆粉添加量1.63%，葡萄糖添加量2.33%，可溶性淀粉添加量3%，磷酸二氢钾添加量0.1%，硫酸镁添加量0.05%，VB1添加量50 mg/L，菌丝体干质量最高达1.94 g/100 mL；发酵液中的胞外多糖质量浓度为431 mg/100 mL；菌丝体胞内多糖质量分数达15.37%，总三萜质量分数达1.36%，蛋白质质量分数为22.93%，多酚质量分数为1.91%。

灵芝；菌丝体；活性成分；胞内多糖；胞外多糖

灵芝（Ganoderma lucidum） 又称神芝、仙草、瑞草，是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，自古以来就是我国珍贵的药食两用菌，具有抗癌、降血压、免疫调节、降血糖、保肝、排毒、抑制组胺释放等功效[1]，市场需求量与日俱增。灵芝活性成分主要为灵芝多糖、三萜类、灵芝多肽等，但成分含量会因所用菌种、菌种产地、栽培方法、提取工艺、制剂方法不同而不同[2]。传统灵芝药用方式是以子实体或孢子入药，子实体纤维化、木质化程度高，苦味浓，而灵芝孢子细胞壁厚，不易被人体利用，二者不宜直接作为食品、药品原料[3]。另外，野生灵芝资源有限，人工栽培灵芝子实体周期较长、成本高，限制了灵芝的广泛应用。目前，利用发酵技术生产真菌具有容积大、产量高、周期短和无污染等特点，已成为医药和保健品、化妆品等原料的重要生产方式[4]。通过液体发酵生产灵芝菌丝体，产品苦味小，营养价值及有效成分不低于子实体，甚至有些指标高于子实体，因而具有广阔的开发和应用前景[4-6]。试验采用摇瓶发酵方法，以灵芝发酵菌丝体干质量和胞外多糖含量为指标筛选最优培养基，测定菌丝体胞内多糖、萜类、蛋白质和多酚含量，为灵芝菌丝体及发酵液的深层次开发与利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

灵芝菌株：赤灵芝，由黑龙江省科学院微生物研究所提供。

1.1.2 试验设备和试剂

UV757CRT型紫外可见光分光光度计，上海精科集团产品；TGL20M-II型离心机，西安莫吉娜仪器制造有限公司产品；RE-53AA型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂产品；KDN-08C型凯氏定氮消化仪，杭州麦哲仪器厂产品；DP-ZDDN-II型凯氏定氮蒸馏装置，北京亚欧德鹏科技有限公司产品；SHB-III型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司产品。

磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铵、葡萄糖、香草醛、冰醋酸、氯仿、甲醇、异丙醇、硼酸、甲基红、高氯酸、硫酸铜、硫酸钾、重蒸酚、硫酸亚铁、酒石酸钾钠为分析纯；可溶性淀粉、白砂糖均为化学纯；浓硫酸为优级纯；酵母膏、蛋白胨、α-淀粉酶、VB1为生物试剂；邻苯二甲酸氢钾为基准试剂；溴甲酚绿、酚酞为指示剂；齐墩果酸为分析标准品。

1.2 试验方法

1.2.1 灵芝菌种活化、扩大培养[7]、菌丝体收集及干质量测定方法

（1）菌种活化培养基：cPDA。

（2） 液体培养基配方。土豆汁添加量20%，麦麸皮添加量5%，可溶性淀粉添加量2%，硫酸镁添加量0.05%，磷酸二氢钾添加量0.1%，酵母膏添加量0.2%。

（3）接种。无菌操作台，用移液枪取2.5 mL灵芝液体菌种接种到装有100 mL培养基的250 mL锥形瓶中，于28℃，120 r/min条件下培养8 d[8]。4层纱布过滤发酵液，菌丝体蒸馏水洗涤，于80℃下烘干至恒质量，称量[9]。

1.2.2 碳源对灵芝菌丝体生长量和胞外多糖含量的影响

根据灵芝生理特性，结合生产实践，选择玉米粉、可溶性淀粉、土豆、葡萄糖、白砂糖作为碳源，在基准培养基（黄豆粉添加量1.5%，磷酸二氢钾添加量0.1%，硫酸镁添加量0.05%，VB1添加量50 mg/L）基础上，分别研究玉米粉添加量（2%，3%，4%）、土豆添加量（10%，20%，30%）、可溶性淀粉添加量（2%，3%，4%）、葡萄糖添加量（2%，3%，4%）和白砂糖添加量（2%，3%，4%） 对灵芝菌丝体生长量和胞外多糖含量的影响。

1.2.3 氮源对灵芝菌丝体生长量和胞外多糖含量的影响

根据灵芝生理特性，结合生产实践，选择黄豆粉、麦麸皮、酵母膏、蛋白胨、硫酸铵作为氮源，在基准培养基（玉米粉添加量3%，磷酸二氢钾添加量0.1%，硫酸镁添加量0.05%，VB1添加量50 mg/L）基础上，分别研究黄豆粉添加量（1.50%，1.75%，2.00%）、麦麸皮添加量（2%，5%，8%）、酵母膏添加量（0.1%，0.3%，0.5%）、蛋白胨添加量（0.1%，0.3%，0.5%） 和硫酸铵添加量（1%，3%，5%） 对灵芝菌丝体生长量和胞外多糖含量的影响。

1.2.4 无机盐添加量对灵芝菌丝体生长量和胞外多糖含量的影响

以基准培养基（3%玉米粉，1.5%黄豆粉，0.05%硫酸镁，50 mg/L VB1）研究添加0.05%～0.30%的磷酸二氢钾对菌丝体生长量和发酵液胞外多糖的影响。

1.2.5 灵芝菌丝体最优配方确定

试验因素与水平设计见表1。

表1 试验因素与水平设计/%

由表1可知，29个试验点为分析因点和零点，其中分析因点取值在X1，X2，X3，X4所构成的三维顶点，2，4，13，16，23为零点试验，重复5次，零点为区域的中心点，用以估计试验误差。按照29个试验点配方分别做培养基，每组3个平行，依次灭菌、冷却、接种，于28℃，转速180 r/min条件下摇动培养8 d。

1.2.6 多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法[10]。

（1） 菌丝体胞内多糖提取、测定。将80℃下烘干的灵芝菌丝体1.0 g，加30倍水，于90℃下浸提1.5 h，以转速10 000 r/min离心20 min，取上清液1，沉淀加30倍水再次浸提1.5 h，离心取上清液2，将沉淀烘干；上清液1和上清液2合并，加入2 mg α-淀粉酶60℃酶解1 h，加水定容至100 mL，精密吸取10 mL，加入40 mL无水乙醇混匀，4℃醇沉12 h，以转速5 000 r/min离心5 min，沉淀用80%乙醇润洗3次，60℃烘干得多糖粗样品，用50 mL蒸馏水溶解，离心，取上清液按照苯酚硫酸法测定多糖含量[10]。

（2）胞外多糖分离、测定。过滤后所得发酵液中加入2 mg α-淀粉酶60℃酶解1 h，测定多糖含量。

1.2.7 萜类含量测定

（1）齐墩果酸标准曲线的绘制。齐墩果酸标准溶液：齐墩果酸标准品10 mg，以甲醇定容至50 mL。依次吸取标准溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL于9支具塞磨口试管中，水浴加热挥去溶剂，加入0.3 mL 5%香草醛冰醋酸溶液和1 mL高氯酸，密封。于70℃下水浴25 min，取出立即冰水冷却，加入冰醋酸10 mL，摇匀，于550 nm处测定吸光度。以吸光值为纵坐标，以齐墩果酸标准溶液体积为横坐标，绘制标准曲线。

（2）灵芝菌丝体总三萜含量的测定。灵芝菌丝体干品2.0 g，加入30 mL氯仿回流提取2 h，过滤后残渣继续回流提取，重复3次，合并滤液并定容至100 mL。精密移取1.0 mL于具塞磨口试管中，水浴加热挥去溶剂，根据标准曲线计算三萜含量[10]。

1.2.8 总氮测定

凯氏定氮法[11]测定蛋白质含量。

1.2.9 多酚类成分测定

（1）样品总多酚提取。干灵芝菌丝体1.0 g磨碎加入80 mL沸水，沸水浴浸提30 min，过滤、洗涤滤渣，将滤液合并、冷却，加蒸馏水定容至100 mL。

（2）多酚含量测定。吸取1 mL样品提取液加入4 mL蒸馏水和5 mL酒石酸亚铁溶液，用pH值7.5磷酸盐缓冲液稀释至25 mL，混匀。以蒸馏水作空白对照，测定540 nm波长处吸光度，计算方法参照文献[12]。

2 结果与分析

2.1 碳源对灵芝菌丝体生长量和胞外多糖含量的影响

碳源种类对菌丝体干质量和胞外多糖含量的影响见图1。

图1 碳源种类对菌丝体干质量和胞外多糖含量的影响

碳源种类对菌丝体生长以及胞外多糖的影响有一定差异。由图1可知，葡萄糖为菌丝体生长最佳碳源，含量为4%时菌丝体干质量产量最多；可溶性淀粉为胞外多糖产量的最佳碳源，含量为4%时胞外多糖产量最多，但可能醇沉时含剩余淀粉；葡萄糖为碳源胞外多糖产量偏少，原因是菌丝体生长过多，发酵液过少。

2.2 氮源对灵芝菌丝体生长量和胞外多糖含量的影响

氮源种类对菌丝体干质量和胞外多糖含量的影响见图2。

氮源种类对菌丝体生长和胞外多糖的影响有一定差异。由图2可知，黄豆粉对菌丝体生长影响最大；黄豆粉和麦麸皮对胞外多糖的影响差异不大，硫酸铵对胞外多糖的影响出现异常的原因是菌丝体长得极少，未消耗的玉米粉被醇沉所致（经试验验证），确定黄豆粉为最佳氮源，其含量为2%时菌丝体干质量最多，1.5%时胞外多糖最多，原因可能是黄豆粉为2%时菌丝体量比1.5%时多，发酵液少导致胞外多糖量少。

2.3 无机盐添加量对灵芝菌丝体生长量和胞外多糖含量的影响

添加一定浓度的无机盐能够促进菌丝生长。液态摇床发酵中，磷酸二氢钾不同添加量的菌丝体生长和胞外多糖产量不同。

无机盐添加量对灵芝菌丝体干质量和胞外多糖含量的影响见图3。

图2 氮源种类对菌丝体干质量和胞外多糖含量的影响

图3 无机盐添加量对灵芝菌丝体干质量和胞外多糖含量的影响

由图3可知，随着磷酸二氢钾添加量增多，菌丝体生长量和胞外多糖产量都呈现先升高后降低的趋势，确定磷酸二氢钾添加量最适范围为0.1%～0.2%。

2.4 响应面图结果分析

根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，选取黄豆粉、葡萄糖、可溶性淀粉、磷酸二氢钾，采用四因素三水平响应面分析设计。

响应面试验设计及数据处理见表2，菌丝体干质量数学回归分析结果见表3，胞外多糖数学回归分析结果见表4。

各因素经过回归拟合，得到回归方程：

表2 响应面试验设计及数据处理

表3 菌丝体干质量数学回归分析结果

表4 胞外多糖数学回归分析结果

由表2可知，菌丝体干质量和胞外多糖回归模型均具有显著性（p＜0.05），失拟性具有不显著性（p＞0.05），说明方程对试验拟合较好。回归方程各项方差分析表明，因素X1，X3，X22，X32对菌丝体干质量和胞外多糖有极其显著性影响，因此，试验因素对菌丝体干质量和胞外多糖影响不是简单线性关系，二次项对其也有很大影响。

葡萄糖和可溶性淀粉添加量对菌丝体干质量响应面见图4，磷酸二氢钾和可溶性淀粉添加量对菌丝体干质量响应面见图5，葡萄糖和磷酸二氢钾添加量对菌丝体干质量响应面见图6，葡萄糖和黄豆粉添加量对胞外多糖响应面见图7，葡萄糖和可溶性淀粉添加量对胞外多糖响应面见图8，葡萄糖和磷酸二氢钾添加量对胞外多糖影响响应面见图9。

运用Design Expert 8.0.6软件对试验结果统计分析，得到灵芝菌丝体生长和胞外多糖产量最优培养基配方为黄豆粉添加量1.63%，葡萄糖添加量2.33%，可溶性淀粉添加量3%，磷酸二氢钾添加量0.1%，硫酸镁添加量0.05%，VB1添加量50 mg/L。

2.5 胞内多糖、萜类、总氮和多酚含量测定结果

葡萄糖标准曲线回归方程Y=0.683 5X-0.013 8，R2=0.997。测得灵芝菌丝体胞内多糖含量为15.37%，比文献报道（10.13%）[13]高接近50%；齐墩果酸标准曲线回归方程为Y=0.768 8X-0.025 3，R2=0.995。测得灵芝菌丝体萜类含量为1.36%，是文献报道（0.33%）[13]的4倍；总氮含量为22.93%；多酚含量为1.91%，目前未见对灵芝菌丝体多酚含量测定的报道。

3 结论

（1）通过响应面试验优化了灵芝培养基，确定灵芝菌丝体生长和胞外多糖产量的最优培养基配方为黄豆粉添加量1.63%，葡萄糖添加量2.33%，可溶性淀粉添加量3%，磷酸二氢钾添加量0.1%，硫酸镁添加量0.05%，VB1添加量50 mg/L；菌丝体干质量达1.94 g/100 mL，胞外多糖质量浓度为431 mg/100 mL；最优培养基经扩大培养得到的菌丝体干重和胞外多糖产量与响应面回归方程得出的结果基本一致。

（2）最优培养基发酵获得的菌丝体中活性成分胞内多糖和萜类含量很高，胞内多糖15.37%，总三萜1.36%，蛋白质22.93%，多酚1.91%。

图4 葡萄糖和可溶性淀粉添加量对菌丝体干质量响应面

图5 磷酸二氢钾和可溶性淀粉添加量对菌丝体干质量响应面

图6 葡萄糖和磷酸二氢钾添加量对菌丝体干质量响应面

图8 葡萄糖和可溶性淀粉添加量对胞外多糖响应面

图9 葡萄糖和磷酸二氢钾添加量对胞外多糖影响响应面

图7 葡萄糖和黄豆粉添加量对胞外多糖响应面

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Optimization of Fermentation Medium by Response Surface Methodology and Active Component Analysis of Ganoderma lucidum

KONG Xianghui1，2，YANG Guoli3，GAO Yang4，*CHEN Xijun3，WANG Hui3，MA Yinpeng1，CHEN Dan3，CHEN He1，CHEN Jingyu1
（1.Institute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin，Heilongjiang 150010，China；2.Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin，Heilongjiang 150001，China；3.Heilongjiang Johnsun Biological Engineering Co.，Ltd.，Harbin，Heilongjiang 150028，China；4.Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150076，China）

The optimal culture medium formula of Ganoderma lucidum was studied in this paper based on dry weight of mycelium and extracellular polysaccharide content，and the active ingredients of mycelium and fermentation broth were also analyzed.The results showed that the optimal culture medium formula of Ganoderma lucidum contains 1.63%soybean powder，2.33%glucose， 3%soluble starch， 0.1%KH2PO4， 0.05%magnesium sulfate， 50 mg/L VB1.Under this formula， the mycelium had 15.37%intracellular polysaccharide， 1.36%terpene content， 22.93%protein content， 1.91%multi phenol content；and the fermentation broth contains 431 mg/100 mL extracellular polysaccharide.

Ganoderma lucidum；mycelium；intracellular polysaccharide；extracellular polysaccharide；active components

S567.31

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.12.010

1671-9646（2017） 12a-0034-05

2017-08-18

哈尔滨市应用技术研究与开发项目（2016RAXYJ046）。

孔祥辉（1971— ），女，博士，研究员，研究方向为食药用菌深加工技术研究与产品开发。

*通讯作者：陈喜君（1969— ），男，博士，研究员，研究方向为菌物药研发。