锦灯笼宿萼总黄酮体外抗氧化活性

钟 方 丽， 王 文 姣,2， 王 晓 林， 罗 亚 宏

( 1.吉林化工学院 化学与制药工程学院, 吉林 吉林 132022；2.吉林大学 化学学院, 吉林 长春 130012 )

锦灯笼宿萼总黄酮体外抗氧化活性

钟 方 丽1， 王 文 姣1,2， 王 晓 林1， 罗 亚 宏1

( 1.吉林化工学院 化学与制药工程学院, 吉林 吉林 132022；2.吉林大学 化学学院, 吉林 长春 130012 )

锦灯笼宿萼；总黄酮；抗氧化

0 引 言

锦灯笼又名红姑娘、灯笼果，为酸浆(PhysalisalkekengiL. var.franchetii(Mast.) Makino)的干燥宿萼或带果实的宿萼[1]，是一种优良的耐寒绿化植物，果实可食用，果实的果红素还可用作食品着色剂。研究表明，锦灯笼宿萼提取物具有降血糖、抗菌、抗癌、调节免疫功能等药理作用[2-3]。其中黄酮类化合物是锦灯笼主要的功效成分之一[4-5]，很多由植物提取的黄酮提取物都具有较好的抗氧化活性及对自由基的清除能力，是目前抗氧剂领域的研究热点，已广泛应用于药品、食品、化妆品等领域[9-10]。人体存在过量的自由基，会诱发各种慢性疾病[11]。黄酮类化合物具有较强的自由基清除能力，为了预防和控制过量自由基对人体带来的不利影响，天然抗氧剂黄酮类化合物成为研究热点之一[12]。锦灯笼宿萼为食药两用型中药材，黄酮为其活性成分之一，本实验探索了锦灯笼宿萼总黄酮提取液对各种自由基及亚硝酸盐的清除活性，并考察了其对Fe3+的还原能力，为锦灯笼宿萼的进一步应用提供了相关依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

锦灯笼宿萼，芦丁对照品，盐酸萘乙二胺，三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，邻二氮菲(1,10-邻二氮杂菲)，铁氰化钾，二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)，其他均为分析纯，水为重蒸馏水。

1.2 方 法

1.2.1 线性范围的确定

精确称取恒重的芦丁对照品10.5 mg，配制成0.21 mg/mL的芦丁对照品溶液。精确移取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL对照品溶液，分别置于6个50 mL容量瓶中，按照文献[13]进行操作，绘制标准曲线，列出回归方程及其线性范围。

1.2.2 总黄酮提取液的制备及含量测定

精确称取适量粉碎的锦灯笼宿萼，按照液料比8∶1(mL/g)加入提取溶剂80%的乙醇水溶液，回流提取2次，每次3 h，过滤，合并滤液，浓缩至50 mL容量瓶中，定容，制备锦灯笼宿萼总黄酮提取液。测定吸光度，计算提取液中总黄酮的含量。

1.2.3 总黄酮提取液的体外抗氧化活性

1.2.3.1 DPPH·清除率的测定

称取适量锦灯笼宿萼总黄酮提取液，加入50%乙醇水溶液，分别配制成总黄酮质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的样品溶液。分别取2.0 mL不同质量浓度的样品溶液，测定517 nm处的吸光度。

称取适量维生素C，分别配制成质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的对照溶液，测定517 nm处的吸光度。计算样品溶液、维生素C对照溶液对DPPH·的清除率[14]。

DPPH·清除率=[(A0-A1+A2)/A0]×100%

式中：A0为空白对照的吸光度，A1为样品溶液的吸光度，A2为对照溶液的吸光度。

1.2.3.2 ·OH 清除率的测定

分别吸取1.0 mL “1.2.3.1”的不同质量浓度的样品溶液，测定536 nm处吸光度。

称取维生素C适量，配制成对照溶液，质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL。计算样品溶液、维生素C对照溶液对·OH的清除率[15]。

·OH清除率=(A′0-A′1)/(A′2-A′1)×100%

式中：A′0为供试液与邻二氮菲、硫酸亚铁、H2O2混合液反应后的吸光度；A′1为蒸馏水代替供试液与邻二氮菲、硫酸亚铁、H2O2混合液反应后的吸光度；A′2为蒸馏水代替供试液与邻二氮菲、硫酸亚铁混合液反应后的吸光度。

称取适量锦灯笼宿萼总黄酮提取液，加入50%乙醇水溶液，分别配制成总黄酮质量浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL的样品溶液，在6个具塞试管中分别放入3.0 mL 50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl缓冲液，25 ℃水浴预热20 min，分别测定320 nm处吸光度。

式中：Ab为蒸馏水代替供试液与邻苯三酚溶液反应后的吸光度；Ac为供试液与邻苯三酚溶液反应后的吸光度；Ad为蒸馏水代替邻苯三酚溶液与供试液反应后的吸光度。

1.2.3.4 还原力的测定

供试品若能被铁氰化钾氧化，则可以将铁氰化钾中的Fe3+还原为Fe2+，从而使溶液显普鲁士蓝色，该溶液在700 nm处有特征吸收，通过该波长下吸光度的高低，可以评价供试品还原力的大小，溶液的吸光度越高，说明供试品的还原能力越大。

在6个具塞试管中分别放入1.0 mL “1.2.3.3”的不同质量浓度供试品溶液，按照文献[17]操作，分别测定A和A′。

称取维生素C适量，配制成与锦灯笼宿萼总黄酮提取液相同质量浓度的对照溶液，同样按文献[17]操作。计算供试液、维生素C对照溶液的还原力。

还原力=A-A′

式中：A为供试液与铁氰化钾溶液反应后的吸光度；A′为蒸馏水代替供试液与铁氰化钾溶液反应后的吸光度。

1.2.3.5 NaNO2清除率的测定

在弱酸性环境下，NaNO2能够与对氨基苯磺酸发生反应生成中间产物，再与盐酸萘乙二胺继续反应，能够生成在538 nm处有强吸收的红色络合物。在相同反应条件下，供试品对NaNO2的清除能力越大，溶液中NaNO2含量则越低，表明供试品对NaNO2的清除活性越高。

在6个具塞试管中分别加入质量浓度为0.20 mg/mL的锦灯笼宿萼总黄酮提取液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL，按照文献[16]操作，分别测定A0、Ai、Aj。

精密吸取质量浓度为0.05 mg/mL的维生素C溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL，按照同样方法操作。计算供试液、维生素C对照溶液对NaNO2的清除率[16]。

NaNO2清除率=[(Ak-Ai+Aj)/Ak]×100%

式中：Ai为加入供试品溶液的吸光度；Aj为供试品溶液的本底吸光度；Ak为不加供试品溶液的吸光度。

1.2.3.6 ABTS+·清除率的测定

ABTS+·通过氧化剂过氧化作用能够生成一种在波长734 nm处有较强特征吸收的自由基阳离子。在体系中加入抗氧化剂，体系中的ABTS+·被清除，溶液在734 nm处的吸光度降低，通过与空白对照组实验结果比较，可以说明供试品对ABTS+·的清除效果，这种方法在天然提取物的抗氧化性研究中应用较多。

按照文献[18]配制ABTS+·基液和工作液。在6个具塞试管中，分别加入“1.2.3.3”中不同质量浓度的总黄酮提取液0.1 mL，按照文献[18]操作，分别测定Af、Ag。

称取维生素C适量，配制成与锦灯笼宿萼总黄酮提取液相同质量浓度的对照溶液，按照同样方法操作。计算供试液、维生素C对照溶液对ABTS+·的清除率[18]。

ABTS+·清除率=[(Af-Ag)/Af]×100%

式中：Af为ABTS+·工作液的吸光度，Ag为加入供试品溶液的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 线性范围及提取液中总黄酮质量浓度的测定

结果表明，芦丁的回归方程为Y=12.382X+0.010 8，R=0.999 6。其线性范围为8.40～50.40 μg/mL。锦灯笼宿萼提取液的总黄酮质量浓度为0.596 mg/mL。

2.2 总黄酮提取液的体外抗氧化性

2.2.1 DPPH·清除率的测定

由图1(a)可知，随着供试品溶液中总黄酮质量浓度的逐渐升高，其对DPPH·的清除率不断增加，当其总黄酮的质量浓度为0.6 mg/mL时，清除率可以达到89.00%。由图1(b)可知，维生素C溶液对DPPH·的清除率也随着其质量浓度的增加而升高，当质量浓度仅为0.06 mg/mL时，DPPH·的清除率达92.06%。实验结果表明，总黄酮提取液对DPPH·具有一定的清除活性，但其清除能力明显弱于维生素C对照溶液。

(a) 总黄酮提取液

(b) VC溶液

图1 总黄酮提取液和VC溶液对DPPH·的清除率

Fig.1 The scavenging activities of extraction solution and VCto DPPH·

2.2.2 ·OH清除率的测定

由图2可知，供试品溶液及维生素C溶液对·OH的清除率均随着二者质量浓度的升高而增加。当质量浓度小于0.4 mg/mL时，供试品溶液的清除率低于维生素C对照溶液，而当二者质量浓度大于0.4 mg/mL时，供试品溶液的清除率明显高于维生素C对照溶液，而且其清除率随质量浓度增加而升高的趋势明显大于维生素C溶液。当二者质量浓度为0.6 mg/mL时，供试品溶液、维生素C溶液对·OH的清除率分别为54.20%、41.28%。结果表明，当质量浓度大于0.4 mg/mL 时，总黄酮提取液·OH的清除能力强于维生素C溶液。

图2 总黄酮提取液和VC溶液对·OH的清除率

图3 总黄酮提取液和VC溶液对的清除率

2.2.4 还原力的测定

由图4可知，供试品溶液及维生素C溶液的还原力均随着二者质量浓度的增加而增大。当二者的质量浓度达到0.12 mg/mL时，供试品溶液及维生素C溶液的还原力分别为0.938和0.943。实验结果表明，黄酮提取液的还原力与维生素C溶液相当。

图4 总黄酮提取液和VC溶液的还原力

2.2.5 NaNO2清除率的测定

由图5可以看出，随着供试品溶液和维生素C溶液用量的增加，其对NaNO2的清除率均逐渐增加，当供试品溶液用量由0.3 mL增加到1.8 mL 时，其对NaNO2的清除率由71.39%增加到89.49%，增加趋势略显平缓，而维生素C溶液用量由0.3 mL增加到1.8 mL时，其对NaNO2的清除率由33.80%增加到95.14%，增加趋势明显。当二者用量均为1.8 mL时，供试品溶液、维生素C溶液的清除率分别为89.49%、95.14%。实验结果表明，总黄酮提取液、维生素C溶液对NaNO2均具有一定的清除活性，但由于实验时供试品溶液的质量浓度为0.20 mg/mL，而维生素C溶液的质量浓度仅为0.05 mg/mL，黄酮提取液对NaNO2的清除能力明显低于维生素C溶液。

图5 总黄酮提取液和VC溶液对NaNO2的清除率

2.2.6 ABTS+·清除率测定实验

由图6可知，供试品溶液及维生素C溶液对ABTS+·的清除率均随着二者质量浓度的升高而逐渐增加。当二者质量浓度为0.12 mg/mL时，供试品溶液对ABTS+·的清除率达94.25%，而维生素C溶液对ABTS+·的清除率仅为45.13%。实验结果表明供试品溶液对ABTS+·具有显著的清除活性，而且明显强于维生素C溶液。

图6 总黄酮提取液和VC溶液对ABTS+·的清除率

3 结 论

锦灯笼宿萼总黄酮提取液的体外抗氧化活性随着总黄酮质量浓度的升高而增大。锦灯笼宿萼是食药两用的天然植物，其总黄酮提取物可以作为天然抗氧化剂用于保健食品、药品、化妆品等领域，该研究为锦灯笼宿萼的进一步综合应用提供了实验依据。

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AntioxidantabilitiesoftotalflavonoidsinvitroinpersistentcalyxofClayxseuFructusPhysalis

ZHONGFangli1,WANGWenjiao1,2,WANGXiaolin1,LUOYahong1

( 1.SchoolofChemistryandPharmaceuticalEngineering,JilinInstituteofChemicalTechnology,Jilin132022,China；2.SchoolofChemistry,JilinUniversity,Changchun130012,China)

persistent calyx ofClayxseuFructusPhysalis; total flavonoids; antioxidant ability

钟方丽,王文姣,王晓林,罗亚宏.锦灯笼宿萼总黄酮体外抗氧化活性[J].大连工业大学学报,2017,36(6):397-401.

ZHONG Fangli,WANG Wenjiao, WANG Xiaolin, LUO Yahong. Antioxidant abilities of total flavonoidsinvitroin Persistent calyx ofClayxseuFructusPhysalis[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(6):397-401.

2016-01-06.

吉林省教育厅资助项目(吉教科合字[2014]第355号).

钟方丽(1970-),女,教授,E-mail:fanglizhong@sina.com;通信作者：王晓林(1969-),男,教授,E-mail:wangxiaolin69@eyou.com.

TS202.3；R927.2

A

1674-1404(2017)06-0397-05