瑞舒伐他汀预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤后E选择素的影响

黄云达，杨 波，王洪雄，黄 伟

（大理大学第六附属医院，昆明 650011）

瑞舒伐他汀预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤后E选择素的影响

黄云达，杨 波，王洪雄，黄 伟*

（大理大学第六附属医院，昆明 650011）

目的：观察瑞舒伐他汀预处理对SD大鼠心肌缺血再灌注损伤过程中E选择素的影响。方法：取健康的雄性SD大鼠共36只，随机分为3组（n=12），即假手术组；缺血再灌注组：先缺血30 min，再灌注180 min；瑞舒伐他汀预处理组：给予瑞舒伐他汀10 mg∕kg，灌胃给药1次∕d，连续3 d，于末次灌胃后，先缺血30 min，再灌注180 min。三组大鼠再灌注180 min后取缺血心肌组织，检测缺血区心肌细胞E选择素的表达水平。结果：瑞舒伐他汀预处理组大鼠心肌细胞E选择素的表达水平均明显低于缺血再灌注组（P＜0．01）。结论：瑞舒伐他汀预处理可以对大鼠心肌缺血再灌注损伤起到一定的保护作用，其机制可能通过减少大鼠心肌细胞E选择素的表达，从而减轻炎性细胞浸润。

瑞舒伐他汀；大鼠；心肌缺血再灌注损伤；E选择素

急性心肌梗死是心肌组织供血中断后引起的心肌缺血性坏死，尽快恢复血供是抢救濒临死亡心肌的最有效方法，目前临床上采用溶栓治疗或PCI（冠状动脉介入手术）治疗实现再通，虽然能获得明显的效果，但不容忽视的是再灌注后不仅不能使器官、组织功能恢复，反而加重器官、组织的结构损伤和功能障碍，造成心肌更为严重和持久的损害。目前我国急性心肌梗死的发病率呈逐年上升趋势〔1〕。因此，如何防治心肌梗死后的心肌缺血再灌注损伤成为近年来关注的热点。目前已知的心肌缺血再灌注损伤的发生机制主要包括血管内皮细胞功能受损、炎性细胞的浸润、心肌细胞凋亡、氧自由基生成增加、能量代谢障碍、钙超载等等，其中炎症反应在心肌缺血再灌注损伤中起关键作用〔2〕。近年来大量临床及动物试验均证实他汀类药物不仅可以降低血脂，减少心血管事件的发生率，并且具有调脂以外的心肌保护作用。大量研究发现他汀类药物的非降脂心肌保护作用主要包括减轻血管内皮损伤、抗炎、抑制心肌凋亡、清除氧自由基、抗氧化作用、逆转心肌肥大等〔3〕。他汀类药物的这些保护作用对于治疗心肌缺血再灌注损伤具有重要的临床意义，尤其对急性心肌梗死（AMI）、急性冠脉综合征（ACS）、冠脉血管重建术后存在心肌缺血再灌注损伤的患者更应尽早应用，减少冠脉事件再发生率及死亡率〔4〕。

前期研究已证实，瑞舒伐他汀预处理具有心肌保护作用，如心肌缺血再灌注损伤的保护〔5-6〕，本研究立足于瑞舒伐他汀的抗炎作用。目前E选择素在心血管疾病中的作用已成为临床研究热点之一。E选择素水平的表达与动脉粥样硬化等许多炎症情况的表达有关，目前认为E选择素水平的变化反映了细胞表面成分的翻转及蛋白质的水解，可作为疾病活动的标志〔7〕。故研究E选择素在心肌缺血再灌注损伤中是否表达，从而阐述心肌缺血再灌注损伤中炎症发生的可能机制。

1 实验材料和方法

1．1大鼠灌胃给药SD雄性大鼠购买自昆明医科大学（合格证号：SCXK（滇）2005-0009），体重介于120～200 g，共36只，将其随机分配为3组，每组12只，分别是：假手术组，缺血再灌注组，瑞舒伐他汀预处理组。假手术组及缺血再灌注组每只大鼠分别按20 mL∕kg给予生理盐水灌胃；瑞舒伐他汀预处理组按10 mg∕kg灌胃给药；连续给药3 d后进行缺血再灌注损伤模型构建。

1．2大鼠心肌缺血再灌注模型的构建按体重3 mL∕kg以100 g∕L水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，并将其固定于仰卧位，与心电图机连接（心电图机为昆明医科大学机能实验室提供），记录实验过程中心电图的变化。剔除心前区体毛后进行常规消毒，经左侧第4肋间切口逐层分离皮下组织、开放胸腔暴露心脏。找到左冠状动脉，于左心耳下缘1 mm处以6-0无菌线完全结扎左冠状动脉，心电图上显示ST段明显弓背向上抬高（≥0．2 mV），表示结扎成功，缺血30 min后，松解结扎线进行再灌注180 min。假手术组只分离埋线，不结扎左冠状动脉，其余同手术组。

1．3缺血区心肌组织的确定再灌注180 min经腔静脉注入1%Evans blue液3 mL进行左室心肌染色后，处死大鼠，迅速取出心脏，以磷酸缓冲液（PBS，pH 7．4）冲洗，用滤纸吸干表面水分，置于-20℃冰箱中快速冷却30 min后，将心脏剪去心耳和右心室，切成2 mm厚的薄片，于1%TTC溶液中37℃温孵15 min，所得心肌组织切片蓝色部分为非缺血区，砖红色部分为缺血未梗死区，灰白色部分为梗死区。

1．4 E选择素（E-selectin）的含量检测E选择素ELSIA试剂盒购于武汉华美生物科技公司。取出试剂盒，室温（18～25℃）下放置至少30 min，按照说明书配制好所需试剂备用。将缺血区心肌组织匀浆，加样：取出96孔板，根据待测样品数量加上标准品的数量选择所需的板条数，冷藏处理剩余板条。分别设标准品孔（7个浓度）、待测样品孔和空白对照孔。每孔分别加标准品或待测样品100 μL轻轻晃动混匀，空白对照孔加入100 μL的蒸馏水，覆上板贴，置于37℃温育2 h；弃去液体，甩干，洗涤3次；每孔加入生物素标记抗体工作液100 μL，贴上新的板贴，置于37℃温育1 h；弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2 min，300 μL∕孔，甩干；每孔加入辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μL，贴上新的板贴，置于37℃温育1 h；弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2 min，300 μL∕孔，甩干。显色：依序每孔加底物溶液90 μL，37℃避光显色15～30 min（为保证实验结果的准确性，底物反应时间到后尽快加入终止液。在加入底物溶液后每隔一段时间观察一下显色情况以控制反应时间。当肉眼见标准品前3～4孔有明显梯度蓝色，后3～4孔不明显时，加入终止液终止反应，此时蓝色立刻变成黄色）。终止：依序每孔加终止液50 μL，终止反应。读板：在反应终止后尽快（5 min内）用酶标仪在450 nm波长测量各孔的OD值。

1．5统计学分析用统计软件SPSS 16．0及Excel进行数据分析，所有数据以（xˉ±s）表示，两组之间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 实验结果

2．1大鼠心肌组织肉眼见结果经TTC和Evans blue染色后所得心肌组织切片，蓝色部分为非缺血区，砖红色部分为缺血未梗死区，灰白色部分为梗死区。肉眼所见缺血再灌注组及瑞舒伐他汀预处理组缺血梗死区面积大于假手术组，而瑞舒伐他汀预处理组缺血未梗死区面积大于缺血再灌注组。见图1。

图1 大鼠心肌组织肉眼切面图

2．2 E选择素（E-selectin）的含量检测结果通过ELSIA法检测不同组中大鼠心肌组织中E选择素的含量，实验数据与实验OD值函数关系见图2。实验数据用单因素方差分析的One way-ANOVA进行统计分析，瑞舒伐他汀预处理组和缺血再灌注组缺血区心肌细胞E选择素的表达水平均高于假手术组（P＜0．01），但瑞舒伐他汀预处理组大鼠心肌细胞E选择素的表达水平均明显低于缺血再灌注组（P＜0．01）。见表1。

图2 大鼠心肌组织E选择素浓度与实验检测所得OD值的函数关系

表1 瑞舒伐他汀预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌细胞E选择素的影响

表1 瑞舒伐他汀预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌细胞E选择素的影响

注：与假手术组相比*P＜0．001，**P＜0．01；与缺血再灌注组相比#P＜0．01。

E选择素∕（pg∕mL）975．3±130．2 2 232．7±251．2*1 306．5±314．6**#组别假手术组缺血再灌注组瑞舒伐他汀预处理组数量∕只12 12 12

3 讨论

急性心肌梗死发生后，通过溶栓等疗法早期恢复缺血部位的血供能够挽救缺血的心肌细胞、防止梗死范围的扩大。但是复灌会造成心肌细胞损伤加重的现象〔8〕。目前已经证实多种中西药具有减轻缺血再灌注损伤的疗效，其中，他汀类药物的疗效尤为突出〔9-10〕。瑞舒伐他汀（rosuvastatin，RSV）是一种选择性3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMGCoA）还原酶抑制剂，是目前最新研发的水溶性他汀，有稳定斑块的作用，在临床上主要用于高脂血症及冠心病的二级预防治疗〔11〕。目前已有大量基础实验证实瑞舒伐他汀与其他他汀类药物一样对心肌缺血再灌注损伤有保护作用〔12-15〕。其保护作用得益于改善内皮功能、抗炎、抗凋亡及抗氧化机制。

本研究立足于他汀的保护血管内皮功能及抗炎作用。炎症的中心环节是由选择素调节的中性粒细胞与血管内皮的黏附，主要是中性粒细胞沿着血管内皮细胞的滚动。E选择素于1985年被科学家发现，1989年其基因被克隆〔16〕。E选择素曾被称为“内皮细胞白细胞黏附分子”，现已被统一命名为E选择素或CD62E。E选择素是诱导性黏附分子，介导白细胞在组织损伤和炎症区域的滚动，参与主要的炎性反应，脂多糖、IL-1（白细胞介素-1）、TNF-α（肿瘤坏死因子α）均可刺激内皮细胞合成E选择素。E选择素是血管内皮细胞受损的标志，它在白细胞与血管内皮细胞黏附的过程中起重要作用，只在细胞因子激活的血管内皮细胞表达，主要介导白细胞与血管壁黏附的首发阶段〔17〕。目前E选择素在心血管疾病中的作用成为临床研究热点之一。E选择素水平的表达与动脉粥样硬化等许多炎症情况的表达有关，目前认为E选择素水平的变化反映了细胞表面成分的翻转及蛋白质的水解，可作为疾病活动的标志〔7〕。故研究E选择素在心肌缺血再灌注损伤中是否表达，从而阐述心肌缺血再灌注损伤中炎症发生的可能机制。

实验结果提示：瑞舒伐他汀预处理组和缺血再灌注组缺血区心肌细胞E选择素的表达水平均高于假手术组（P＜0．01），但瑞舒伐他汀预处理组大鼠心肌细胞E选择素的表达水平均明显低于缺血再灌注组（P＜0．01）。

他汀类药物的多效性作用使其应用范围逐步扩大，包括减少心肌缺血再灌注损伤，其中负荷量给药及药物亲水性差异是其发挥作用的关键〔18-21〕。本实验检测心肌炎症因子E选择素的变化来阐明缺血后处理的保护机制与减轻炎症反应的相关性，在国内尚未见到该方面的研究。瑞舒伐他汀预处理能减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤，这种作用可能与其降低再灌注心肌炎性细胞因子表达相关，而不依赖于其降脂作用，为瑞舒伐他汀预处理的临床应用提供了新的理论依据。

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（责任编辑 李 杨）

Effects of Rosuvastatin Pretreatment on E Selectin after Myocardial Ischemia Reperfusion Injury in Rat

Huang Yunda,Yang Bo,Wang Hongxiong,Huang Wei*
（The Sixth Affiliated Hospital of Dali University,Kunming 650011,China）

Objective：To observe the effects of rosuvastatin on the expression of E selection in treating myocardial ischemiareperfusion injury in SD rats．Methods:36 male healthy SD rats were randomly divided into 3 groups（n=12）,including the sham operation group,the ischemia reperfusion group with 30 min of ischemia and 180 minutes of reperfusion,and the minand rosuvastatin pretreatment group which was given rosuvastatin 10 mg∕kg,fasting lavage once-daily for 3 consecutive days and reperfusion of 180 min after the final lavage before 30 min of ischemia．After 180-min reperfusion in the 3 groups the myocardial tissue of ischemic zone was taken to detect the expression level of E selection in ischemic myocardium．Results：The expression level of E selection in the myocardial cells of rosuvastatin pretreatment group was significantly lower than that of ischemia reperfusion group（P＜0．01）．Conclusion：Rosuvastatin preconditioning on myocardial ischemia reperfusion injury in rats has a protective effect;the mechanisms may be related to the fact that the infiltration of inflammatory cells decreases as the myocardial cells of rats with E selection expression reduce．

rosuvastatin calcium tablets;rats;myocardial ischemia reperfusion injury;E selection

R654．2

A

2096-2266（2017）10-0029-04

10．3969 ∕j．issn．2096-2266．2017．10．007

云南省应用基础研究计划资助项目（2013FD094）

2017-04-19

2017-05-06

黄云达，住院医师，主要从事心血管疾病的诊治研究．*通信作者：黄伟，主任医师．