红花蜂花粉多糖提取工艺的研究

李 月，王 昀，罗永会，陈贵元，左绍远，2*

（1．大理大学基础医学院，云南大理 671000；2．云南省昆虫医药研发重点实验室，云南大理 671000）

红花蜂花粉多糖提取工艺的研究

李 月1，王 昀1，罗永会1，陈贵元1，左绍远1，2*

（1．大理大学基础医学院，云南大理 671000；2．云南省昆虫医药研发重点实验室，云南大理 671000）

目的：研究红花蜂花粉多糖的最佳分离提取工艺。方法：以多糖提取率为考察指标，用水提醇沉法和微波提取法分离提取红花蜂花粉多糖。通过单因素试验和L9（34）正交试验，比较两种方法对多糖得率的影响。结果：工艺验证实验结果表明，微波提取法最佳提取工艺为料液比1：18 g∕mL、功率500 W、时间7 min，多糖提取率为34．60%；水提醇沉法最佳提取工艺为：料液比1：18 g∕mL、时间10 h、温度80℃、提取次数4次，多糖提取率为38．00%。结论：水提醇沉法比微波提取法的多糖得率高，工艺路线稳定可行，可作为红花蜂花粉多糖分离提取的最佳工艺路线。

红花蜂花粉多糖；正交试验；工艺优化；水提醇沉法；微波提取法

红花（Carthamus tinctorius L．）为菊科红花属草本植物，味辛、性温，具有活血通经、祛瘀止痛等功效，是一种传统中药〔1-2〕。蜂花粉（bee pollen）是蜜蜂从蜜源植物花蕊内采集的花粉粒，并加入了特殊的腺体分泌物（花蜜和唾液）混合而成的一种不规则扁圆形或淡黄色团状物，为传统天然营养食品。含有多糖等多种生物活性物质，具有多种生物学活性和药理作用〔3〕。研究表明，不同来源的蜂花粉多糖具有免疫调节、抗肿瘤等多种生物学活性〔4-8〕。

目前有关其他蜂花粉来源的多糖研究较多，但红花蜂花粉多糖的研究少见报道〔9〕。为综合开发利用云南丰富的红花蜂花粉资源，本实验采用两种方法对其提取工艺路线进行研究，以期探索出最佳提取工艺路线，从而为红花蜂花粉多糖的后续研究提供基础数据。

1 材料

破壁红花蜂花粉，购于云南滇峰蜂业有限责任公司产品（批号：20140712），为黄色粉末状；D-无水葡萄糖（含量≥99%，批号：110833-201506，中国食品药品检定研究院）；水为去离子水；其他试剂均为国产分析纯。

仪器：FST-Ⅲ-20普力菲尔超纯水机（上海富诗特仪器设备有限公司）；SHA-C恒温水浴箱（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；AG135电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚东生化仪器厂）；FD-1型冷冻干燥机（北京博医康技术有限公司）；722E可见光分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；LD4-2A低速离心机（北京市医用离心机厂）；SHZ-3循环水多用真空泵（上海青浦沪西仪器厂）；PD70D20P-TD（W0）格兰仕微波炉（输出功率700 W，广东格兰仕微波炉电器制造有限公司）。

2 方法

2．1葡萄糖标准曲线的绘制准确称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品0．1 g于100 mL的容量瓶中，加水定容。取10 mL于另一100 mL容量瓶中，加水定容，得100 μg∕mL的葡萄糖标准溶液〔10〕。取干燥试管10支，分别加入葡萄糖标准溶液0．05、0．10、0．20、0．30、0．40、0．50、0．60、0．70、0．80、0．90 mL，各管加水补至2 mL，迅速加入质量分数6．0%苯酚溶液1．0 mL及浓硫酸5．0 mL，摇匀，室温静置30 min。另取水2．0 mL同法操作，加入6．0% 苯酚溶液1．0 mL和浓硫酸5．0 mL，此为空白对照管，在490 nm处测吸光度值（A），以A为纵坐标，葡萄糖浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线回归方程为A=0．016 07C-0．013 97（r=0．999 82），显示在 2．5～45．0 μg∕mL 的葡萄糖质量浓度与吸光度呈良好的线性关系。

2．2红花蜂花粉多糖提取率的测定水提后，离心取上清液，定容至250 mL，取50 μL，稀释至2 mL，用苯酚-硫酸比色法测定吸光度值代入标准曲线方程中，得其多糖的含量。红花蜂花粉多糖的提取率按下式计算。

红花蜂花粉多糖提取率=［（多糖质量分数×2×体积倍数）∕红花蜂花粉质量］×100%

2．3红花蜂花粉多糖提取工艺流程红花蜂花粉→萃取回流（2倍体积石油醚，无水乙醇脱脂2次，每次2 h）→水提、离心→减压浓缩、醇沉→离心、沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤→冷冻干燥→红花蜂花粉多糖粗品（本实验中着重考察水提过程中的相关因素）。

2．4水提醇沉法单因素实验

2．4．1 料液比对红花蜂花粉多糖得率的影响 称取等量（1．0 g）红花蜂花粉7份，在提取时间8 h，提取次数1次，提取温度75℃条件下，考查不同料液比（1：3、1：6、1：9、1：12、1：15、1：18、1：21 g∕mL）对红花蜂花粉多糖提取率的影响。

2．4．2 提取时间对红花蜂花粉多糖得率的影响 称取等量（1．0 g）红花蜂花粉6份，在料液比1：18 g∕mL，提取次数1次，提取温度75℃条件下，考查不同提取时间（4、6、8、10、12、14 h）对红花蜂花粉多糖提取率的影响。

2．4．3 提取温度对红花蜂花粉多糖得率的影响 称取等量（1．0 g）红花蜂花粉6份，在料液比1：18 g∕mL，提取次数1次，提取时间10 h条件下，考查不同提取温度（60、65、70、75、80、85 ℃）对红花蜂花粉多糖提取率的影响。

2．4．4 提取次数对红花蜂花粉多糖得率的影响 称取等量（1．0 g）红花蜂花粉5份，在料液比1：18 g∕mL，提取温度80℃，提取时间10 h条件下，考查不同提取次数（1、2、3、4、5次）对红花蜂花粉多糖提取率的影响。

2．4．5 水提醇沉法正交试验设计 以红花蜂花粉多糖提取率为评价指标，在单因素试验的基础上，选定L9（34）4因素3水平进行正交试验，以确定最优红花蜂花粉多糖提取工艺参数。见表1。

表1 正交试验因素与水平

2．5微波法单因素实验

2．5．1 料液比对红花蜂花粉多糖得率的影响 称取等量（1．0 g）红花蜂花粉7份，在提取时间3 min，提取功率400 W条件下，考查不同料液比（1：3、1：6、1：9、1：12、1：15、1：18、1：21 g∕mL）对红花蜂花粉多糖提取率的影响〔11〕。

2．5．2 提取功率对红花蜂花粉多糖得率的影响 称取等量（1．0 g）红花蜂花粉5份，在提取时间3 min，料液比1：21 g∕mL条件下，考查不同提取功率（300、400、500、600、700 W）对红花蜂花粉多糖提取率的影响。

2．5．3 提取时间对红花蜂花粉多糖得率的影响 称取等量（1．0 g）红花蜂花粉6份，在料液比1：21 g∕mL，提取功率500 W条件下，考查不同提取时间（2、3、4、5、6、7 min）对红花蜂花粉多糖提取率的影响。

2．5．4 微波法正交试验设计 以红花蜂花粉多糖提取率为评价指标，在单因素试验的基础上，选定L9（33）3因素3水平进行正交试验，以确定最优红花蜂花粉多糖提取工艺参数。见表2。

表2 正交试验因素与水平

2．6统计分析以红花蜂花粉多糖提取率为评价指标，同等条件下每组实验平行3次，以降低实验中所出现的误差，采用SPSS 21．0软件对实验结果进行分析，P＜0．05为差异具有统计学意义，以优选出红花蜂花粉多糖的最佳提取工艺。

3 结果与结论

3．1水提醇沉法单因素试验结果

3．1．1 料液比对红花蜂花粉多糖提取率的影响料液比在1：（3～18）g∕mL之间，红花蜂花粉多糖的提取率逐渐增加，料液比1：18 g∕mL时提取率达到最大值；当水量继续增加后提取率呈下降的趋势。其原因可能为料液比较小时，随提取液的增加有利于红花蜂花粉多糖的溶出；但料液比超过1：18 g∕mL时，红花蜂花粉多糖提取率趋于平稳，基本不再增加。所以最佳料液比为1：18 g∕mL。见图1。

图1 料液比对多糖提取率的影响

3．1．2 提取时间对红花蜂花粉多糖提取率的影响随提取时间的延长红花蜂花粉多糖的提取率也相应增加，当提取时间为12 h时，提取率达到最大值；提取时间继续增加时，提取率呈下降趋势。其原因可能为在一定时间范围内，随提取时间的增加，红花蜂花粉多糖的溶出逐渐增加；当提取时间为12 h时，样品中的红花蜂花粉多糖已基本全部溶出，而后随提取时间的继续增加，红花蜂花粉多糖的提取率趋于平稳。提取时间10 h与12 h、12 h与14 h相比，差异无统计学意义（P＞0．05）（n=4），对提取率无明显差异，而提取时间过长将导致费时费力，成本增加，因此综合考虑，选择10 h较为经济可行。见图2。

图2 提取时间对多糖提取率的影响

3．1．3 提取温度对红花蜂花粉多糖提取率的影响在60～80℃之间，红花蜂花粉多糖的提取率随温度的升高而大幅升高，当提取温度达到80℃时，提取率达到最大值；当提取温度进一步升高时，提取率明显下降。其原因可能为温度较低时，红花蜂花粉中多糖与其他物质结合紧密，使得红花蜂花粉多糖不易溶出，因而提取率偏低；当提取温度超过80℃时，会导致红花蜂花粉多糖部分水解，从而影响红花蜂花粉多糖的提取率。所以最适提取温度为80℃。见图3。

图3 提取温度对多糖提取率的影响

3．1．4 提取次数红花蜂花粉多糖提取率的影响随提取次数的增加红花蜂花粉多糖的提取率呈上升趋势，当提取次数5次时，提取率达到最大值。其原因可能为次数较少时，红花蜂花粉多糖仅部分溶出，因而红花蜂花粉多糖提取率偏低；当次数增加到5次时，红花蜂花粉多糖已基本全部溶出，红花蜂花粉多糖的提取率也趋于平稳。提取次数3次与4次、4次与5次之间，差异均无统计学意义（P＞0．05）（n=4），提取率无明显差异，提取次数增加，使后续减压浓缩、醇沉等工艺的成本增加，所以最佳提取次数为4次。见图4。

图4 提取次数对多糖提取率的影响

3．2水提醇沉法正交试验结果与方差分析据表3中的R值可以得出，各因素对多糖提取率的影响程度依次为料液比（A）＞提取次数（D）＞提取温度（C）＞提取时间（B）。由表4的方差分析结果可知，各因素对提取率的影响均具有统计学意义（P＜0．001），各因素对红花蜂花粉多糖提取率的影响顺序与极差分析结果相吻合。红花蜂花粉多糖水提醇沉法最优工艺为A1B3C2D3，即料液比1：15 g∕mL、提取时间12 h、提取温度80℃、提取次数4次。见表3～4。

表3 L9（34）正交试验结果

3．3微波法单因素实验结果

3．3．1 料液比对红花蜂花粉多糖提取率的影响红花蜂花粉多糖的提取率随料液比的增大而增加，料液比1：21 g∕mL时提取率达到最大值。其原因可能为料液比较小时，随提取液的增加有利于红花蜂花粉多糖的溶出；料液比1：21 g∕mL时，红花蜂花粉多糖提取率趋于平稳，基本不再增加。所以最佳料液比为1：21 g∕mL。见图5。

图5 料液比对多糖提取率的影响

3．3．2 提取功率对红花蜂花粉多糖提取率的影响在功率300～500 W之间，红花蜂花粉多糖提取率随功率的增大而增加，功率为500 W时提取率达到最大值；当功率继续增大时，提取率反而下降。其原因可能为功率较低时，红花蜂花粉多糖不易溶出，因而提取率偏低；当提取功率超过500 W时，会导致红花蜂花粉多糖部分水解，从而影响红花蜂花粉多糖的提取率。所以最佳功率为500 W。见图6。

图6 提取功率对多糖提取率的影响

3．3．3 提取时间对红花蜂花粉多糖提取率的影响红花蜂花粉多糖提取率随时间的增加而增加，在7 min时达到最大值。其原因可能为随提取时间的增加，红花蜂花粉多糖的溶出逐渐增加；当提取时间为7 min时，样品中的红花蜂花粉多糖已基本全部溶出，红花蜂花粉多糖的提取率趋于平稳。所以最佳时间为7 min。见图7。

图7 提取时间对多糖提取率的影响

表4 正交试验方差分析结果

3．4微波法正交试验结果与方差分析根据表5中的R值可以得出，各因素对多糖提取率的影响程度依次为料液比（A）＞提取时间（B）＞提取功率（C）。由表6的方差分析结果可知，各因素对多糖提取率的影响差异不具有统计学意义（P＞0．05），各因素对多糖提取率的影响顺序与极差分析结果相吻合。红花蜂花粉多糖微波法最优工艺为 A2B3C2，即料液比 1：18 g∕mL、提取时间7 min、提取功率500 W。见表5～6。

3．5提取工艺验证选取3种方案进行试验验证，即微波提取法正交试验最优工艺A2B3C2，水提醇沉法单因素试验组合：料液比1：18 g∕mL、时间10 h、温度80℃、提取次数4次，水提醇沉法正交试验最优工艺A1B3C2D3。结果微波提取法正交试验最优工艺A2B3C2多糖平均提取率为34．60%（n=3，RSD=0．33%），水提醇沉法单因素试验组合：料液比1：18 g∕mL、时间10 h、温度80℃、提取次数4次的多糖平均提取率为38．00%（n=3，RSD=0．15%），水提醇沉法正交试验最优工艺A1B3C2D3多糖平均提取率为37．83%（n=3，RSD=0．45%）。3种方案工艺稳定可行。其中水提醇沉法单因素试验组合的多糖提取率最高。

表5 L9（33）正交试验结果

表6 正交试验方差分析结果

4 讨论

由工艺验证结果可知，水提醇沉法的多糖得率高，比微波提取法高3．4%，因此选择水提醇沉法。同时又比较水提醇沉法的两种方法，即：单因素试验组合和正交试验最优工艺，虽然两种工艺的多糖提取率差异无统计学意义（P＞0．05），但是单因素试验组合的料液比为1：18 g∕mL、时间为10 h，比正交试验最优工艺省时且提取更完全。因此综合考虑水提醇沉法最佳提取工艺为单因素试验组合，即：料液比1：18 g∕mL、时间10 h、温度80 ℃、提取次数4次，多糖平均提取率为38．00%。该提取方法更利于红花蜂花粉多糖的提取，为其后续研究提供基础实验数据。

〔1〕江苏医学院．中药大辞典：上册〔M〕．上海：科学技术出版社，1986．

〔2〕魏桂芳，徐磊，姚宏．红花的鉴定标准与药理研究〔J〕．陕西中医，2010，31（6）：736-737．

〔3〕刘建涛，赵利，苏伟，等．蜂花粉生物活性物质的研究进展〔J〕．食品科学，2006，27（12）：909-912．

〔4〕吴盼盼，段元锋，徐德平．油菜蜂花粉多糖的分离鉴定及免疫活性研究〔J〕．食品与生物技术学报，2015，34（10）：1040-1044．

〔5〕王博，张梦珊，张中玉，等．菊花蜂花粉多糖的分离纯化及抗肿瘤活性研究〔J〕．食品工业科技，2016，37（5）：358-360．

〔6〕魏淑飞，左绍远．蜂花粉多糖生物活性研究进展〔J〕．生命科学仪器，2014，12（4）：15-17．

〔7〕张翠香，罗永会，陈贵元．苍山野茶花蜂花粉多糖降血糖的生物活性研究〔J〕．考试周刊，2016（42）：193-194．

〔8〕万顺康，张翠香，林春榕，等．荞麦蜂花粉多糖对肉仔鸡免疫功能、血脂及抗氧化能力的影响〔J〕．饲料工业，2013，34（18）：11-15．

〔9〕刘嘉，李锐，李銮熙，等．蜂花粉功能性多糖的研究进展〔J〕．广东农业科学，2012，39（11）：125-127．

〔10〕张惟杰．糖复合物生化研究技术〔M〕．杭州：浙江大学出版社，1999．

〔11〕杨申明，王振吉，李艳婷．微波法提取金雀花多糖工艺研究〔J〕．食品工业，2015（4）：136-140．

（责任编辑 李 杨）

Comparative Research on the two Extraction Processes of Polysaccharides from Bee Pollen of Carthamus tinctorius

Li Yue1,Wang Yun1,Luo Yonghui1,Chen Guiyuan1,Zuo Shaoyuan1,2*
（1．Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2．Key Laboratory of Pharmaceutical Ramp;D of Insects in Yunnan Province,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the best extracting technique of polysaccharides from bee pollen of Carthamus tinctorius．Methods:Taking the yield of polysaccharide as indicator,the polysaccharide of bee pollen of Carthamus tinctorius L was isolated by water extracting-alcohol precipitating method and microwave power method．Then by the use of orthogonal experiment and single factor test,the results of the two methods on the extraction yields of polysaccharides were compared．Results:The results of verification tests showed that the best extraction technology of microwave power method was 1∶18 g∕mL for the ratio of material to liquid,500 watts for microwave power and 7 min for extraction time．Under these process conditions,the yield of polysaccharide was 34．60%．And the best conditions of water extracting-alcohol precipitating method was 1∶18 g∕mL for the ratio of material to liquid,80 ℃ for extracting temperature,10 h for time and 4 times for extraction．The yield of polysaccharide was 38．00% ．Conclusion:The yield of polysaccharide of water extracting-alcohol precipitating method is better than the microwave power method．It is stable and feasible to use this method as the best extraction process of polysaccharides from bee pollen of Carthamus tinctorius．

polysaccharides from bee pollen of carthamus tinctorius;orthogonal experiment;extracting technology;extractingalcohol precipitating;microwave power

R284．2

A

2096-2266（2017）10-0024-05

10．3969 ∕j．issn．2096-2266．2017．10．006

国家自然科学基金资助项目（31460231）；云南省科技厅高新科技计划资助项目（GX10-2004）；云南省昆虫生物医药研发重点实验室资助项目（2014-10）

2016-12-06

2017-08-13

李月，硕士研究生，主要从事多糖的分离纯化与生物学活性研究．*通信作者：左绍远，教授．