解毒退热颗粒的质量标准研究

向采芹， 冯建安， 李希,*， 黄嫣， 周方

·炮制制剂·

解毒退热颗粒的质量标准研究

向采芹1， 冯建安2， 李希1,2*， 黄嫣2， 周方1

目的：对退热解毒颗粒进行质量标准研究。方法：采用薄层色谱法对制剂中黄芩，葛根，重楼，青蒿等药味进行定性鉴别，采用高效液相色谱法对制剂中主要有效成分黄芩苷进行定量鉴别。结果：薄层色谱鉴别显示颗粒与黄芩，重楼等四味对照药材或者对照品在相同位置显示相同颜色的斑点或荧光斑点，阴性无干扰。高效液相色谱结果显示在在0.0118～0.118 mg⋅mL-1范围内线性关系良好，平均回收率为100.24%。结论：该方法专属性强，稳定可靠，重现性好，可用于对解毒退热颗粒的质量控制。

解毒退热颗粒；质量标准；薄层色谱；高效液相色谱

解毒退热颗粒是四川省中医药科学院中医研究所儿科主任根据多年临床的经验方。处方是由黄芩、柴胡、重楼、葛根等中药制成的治疗风热挾湿证型的小儿外感发热的中药复方制剂。

具有解毒退热，定惊化湿之功效，不仅退热效果好，且针对小儿心常有余，肝常有余，高烧易惊厥的病理特征有明显的治疗作用，无明显的毒副作用。黄芩具有抗病毒抗菌、抗氧化、抗肿瘤等一系列药理作用[1]。

本实验对溶液制备进行了优化，同时对黄芩等药味的薄层色谱鉴别方法进行改进，为颗粒制剂的质量控制和其指量标准的制定提供了可靠依据，保证了临床用药的合理，安全，高效。

1 仪器与试药

1.1 仪器与设备

AgiLent-1260 高效液相色谱仪 ( 美国安捷伦科技有限公司)；KQ-300DE 型数控超声波清洗器 ( 昆山市超声仪器有限公司)；BT-125D 型电子天平 ( 赛多利斯科学仪器北京有限公司)；CS101 电热鼓风干燥箱 ( 重庆实验设备厂制造)；电热恒温水浴锅北京市永光明医疗仪器有限公司)；LK-1000A500 g 摇摆式高速中药粉碎机 ( 浙江温岭市创力药材器械厂制造)。GoodLook-1000型薄层色谱成像系统（上海科哲生化科技有限公司）。

1.2 试药

试药：黄芩苷对照品（批号：110715-201318，中国食品药品检定研究院），重楼对照药材（批号：110712-201316，中国食品药品检定研究院），葛根素对照品（批号：110752-201313，中国食品药品检定研究院，青蒿对照药材（批号：110714-201319，中国食品药品检定研究院）；黄芩，重楼，葛根，青蒿药材饮片（四川省中药饮片有限责任公司）。

试剂：乙醚，乙酸乙酯，丁酮，甲酸，无水乙醇，石油醚，三氯甲烷为分析纯，5%三氯化铁乙醇溶液，10%硫酸乙醇溶液，甲醇，磷酸为色谱纯（美国 fi sher公司），水为超纯水（自制）。

2 薄层色谱定性色谱鉴别

2.1 黄芩的薄层色谱鉴别

取解毒退热颗粒5 g，加乙醚30 mL，超声提取15 min，挥干乙醚，残渣加家甲醇30 mL，超声提取30 min，过滤得滤液加15 mL水调节pH值为1-2，用20 mL乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，将萃取液蒸干，残渣加2 mL甲醇溶液作为供试品。另取缺黄芩的颗粒按上述方法制成阴性供试品。再取黄芩苷对照品加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法实验，吸取上述供试品溶液及对照品溶液各5 uL，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）为展开剂[2]，预饱和15 min，上行展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铁乙醇溶液，在日光下检视。供试色谱中，在与对照品相同位置显示相同暗绿色斑点，阴性样品无斑点，见图1。

图1 黄芩薄层色谱鉴别

2.2 青蒿的薄层色谱鉴别

取本品颗粒5 g，加甲醇30 mL，超声提取15 min，滤过，将滤液蒸干，残渣加无水乙醇1mL溶解，作为供试品溶液。取缺青蒿的颗粒5 g，按同法制成阴性供试品溶液。另取青蒿对照药材1 g，加50 mL水回流提取30 min，滤过，滤液蒸干残渣加30 mL甲醇，超声提取15 min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。按照薄层色谱法，吸取上述三种试液各2-3 μL，分别点于同一以0.4% 羧甲基纤维素钠为粘合剂的，硅胶G薄层板上，以石油醚（60-90）-乙醚（1∶4）为展开剂[3]，饱和30 min，上行展开，取出，晾干至紫外灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相对应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点，见图2。

图2 青蒿薄层色谱鉴别

2.3 葛根的薄层色谱鉴别

取本品颗粒5 g，加甲醇30 mL，超声30 min,滤过，滤液蒸干残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。按照同法取不含葛根的颗粒，制成阴性供试品溶液。另取葛根素对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，在吸取上述三种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）为展开剂，饱和30 min，上行展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏5 min，置紫外灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相对应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点，见图3。

图3 葛根薄层色谱鉴别

2.4 重楼的薄层色谱鉴别

取本品颗粒5 g，加乙醇10 mL，加热回流30 min,滤过，滤液作为供试品溶液。按照同法取不含重楼的颗粒，制成阴性供试品溶液。另取重楼对照药材，同上述方法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，在吸取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（15∶5∶1）为展开剂，饱和30 min，上行展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇，在105 ℃加热至斑点显色清晰，分别置紫外灯（365 nm）和日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相对应的位置上，显示相同颜色的褐色斑点和荧光斑点，见图4。

图4 重楼薄层色谱鉴别

3 黄芩苷的含量测定

3.1 色谱条件

AgiLent 1260型高效液相色谱仪，DAD二极管阵列检测器，色谱柱Shim-pack VP-ODS C18柱（4.6×150 mm，5 um）；流动相为甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）[4]；流速：1 mL⋅min-1；柱温25 ℃；紫外检测波长：280 nm。

3.2 供试品溶液制备方法的优化

3.2.1 提取方法的选择 取本品（批号：160201）约0.5 g各2份，精密称定，加70%乙醇适量，分别采用回流30分钟及超声处理30分钟，回流所测得的黄芩苷的含量为24.357 mg⋅g-1，超声处理所测得的黄芩苷含量为25.013 mg⋅g-1。结果表明，超声处理和回流提取的结果差异不大，比较而言，超声处理较回流提取方便，因此，本文选用超声处理方法。

3.2.2 超声时间的选择 取本品（批号：160201）约0.5 g各2份，精密称定，加70%乙醇适量，分别超声处理（超声功率300W，频率50kHz）15分钟、30分钟、45分钟，分别对应的黄芩苷的含量为21.054、25.021、25.249 mg⋅mL-1。结果表明，不同超声处理时间对结果有一定影响。超声处理30分钟，供试品中的黄芩苷已基本提取完全，因此，本文选用超声处理30分钟。根据以上结果，确定供试品制备方法为：取本品约0.5 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加70%乙醇适量，超声提取30分钟，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，离心，精密量取上清液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

3.3 标准曲线的绘制

对照品溶液的制备：取在60 ℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品5.90 mg（批号：110715-201318），于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得0.590mg⋅mL-1的对照品储备液。精密吸取一定量的储备液，并分别稀释至浓度为0.0118 mg⋅mL-1、0.0236 mg⋅mL-1、0.0354 mg⋅mL-1、0.0472 mg⋅mL-1、0.059 mg⋅mL-1、0.118 mg⋅mL-1的对照品溶液，即得。照高效液相色谱法试验，分别精密吸取上述黄芩苷对照品溶液10μL注入高效液相色谱仪，照上述色谱条件测定峰面积，外标法计算黄芩苷的含量。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，黄芩苷对照品的浓度（X）（mg⋅mL-1）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为 y = 29 164x - 19.612，r=0.9995结果表明：在0.0118～0.118 mg⋅mL-1范围内，黄芩苷峰面积积分值与进样量的线性关系良好。

3.4 阴性干扰的判断

阴性样品溶液的制备：取缺黄芩的阴性样品0.5 g，按供试品溶液的制备项下方法同法制成阴性样品溶液。将阴性样品溶液、样品溶液、对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果阴性样品在黄芩苷峰处无干扰，结果如图1。

图5 黄芩苷对照品（A）；供试样品（B）；阴性供试品（C）

3.5 精密度试验

精密吸取对照品和供试品溶液(浓度为0.059 mg⋅mL-1)各10 µL，连续进样6次，测定黄芩苷的峰面积，结果对照品的平均峰面积为1 693.41，RSD值为0.76%。供试品的平均峰面积为1 411.54，RSD值为1.41%。以上结果表明，对照品溶液和供试品溶液的精密度良好。

3.6 稳定性试验

精密吸取对照品溶液和供试品溶液10 µL分别于0小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时，注入高效液相色谱仪，测定黄芩苷的峰面积，结果对照品溶液的平均峰面积为1 169.45，RSD值为0.46%，供试品溶液的平均峰面积为1 412.46，RSD值为1.48%。结果表明，对照品溶液和供试品溶液均在48小时内稳定。

3.7 重复性试验

对同一批样品取样6份，分别按前述供试品溶液的制备方法及色谱条件进行测定，测得的黄芩苷的平均含量为25.07 mg⋅g-1，RSD值为1.31%。结果表明，本法具有良好的重复性。

3.8 回收率试验

取已知含量的样品约0.25 g，分别加入黄芩苷对照品适量，按前述供试品溶液的制备方法及色谱条件进行测定，结果见下表2。

表2 回收率试验结果

回收率的计算公式为：

以上试验结果表明：本法回收率良好。

3.9 耐用性试验

取样品，按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，使用不同品牌色谱柱（分别为Shim-pack VP-ODS柱（150×4.6 mm，5 μm）；AgiLent ZORBAX SB C18柱（4.6×150 mm，5 um）），进行耐用性试验，结果黄芩苷的含量分别为25.068、25.138 mg⋅g-1。

3.10 样品的测定及含量限度的确定

取三批中试样品，按前述拟定的含量测定方法进行测定，结果见表3。

表3 样品中黄芩苷的测定结果（n=2）

根据以上测定结果，考虑到药材的来源及药材中黄芩苷含量差异，以及制剂生产、贮藏等因素，故本标准暂定本品每袋含黄芩以黄芩苷（C21H18O11）计，不得少于180 mg。

4 讨论

在退热解毒颗粒的薄层色谱定性鉴别过程中，不仅对其主要功效的黄芩做定性鉴别，还对葛根，青蒿，从楼等药味做了定性鉴别，鉴别过程中，根据药典方法对四味药进行鉴别，其中葛根，青蒿，重楼三味药的药典方法稳定可行，黄芩可能受温度、湿度、和药物本身的影响，结果不太理想，因此本文在查阅大量相关文献进行不断试验，最终确定本文中所述的黄芩的薄层色谱的鉴别方法。

对于解毒退热颗粒的含量测定，因黄芩苷为其主要成分，稳定且分离度较高，本文选取黄芩苷作为指标，在参照中国药典所给黄芩苷含量测定的方法，最终本文确定了将药典的流动相比例更改为甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2），能达到更好的分离效果，重现性、稳定性均较好。在样品处理过程中进行了方法的优化制订了相对而言高效经济的处理方案，最终制定了解毒退热颗粒的定性和定量的测定方法。本文所述研究方法简便可行，薄层色谱定性研究斑点清晰，专属性强；高效液相定量鉴别重复性好，结果准确，故方法可行，具有实际意义。

[1] 宋琳莉,孟庆刚. 黄芩的药理作用研究进展[J]. 中华中医药学刊,2008,(08)∶1676-1678.

[2] 王野. 小儿感冒宁糖浆的薄层鉴别及黄芩苷的含量测定[J].成都中医药大学学报,2006,(02)∶59-64.

[3] 国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）[S].北京∶中国医药科技出版社,2015.

[4] 乔莉. HPLC法测定八宝惊风散中黄芩苷的含量[A]. 中国药学会、江苏省人民政府.2012年中国药学大会暨第十二届中国药师周论文集[C].中国药学会、江苏省人民政府,2012,6.

Quality standard of Jiedu Tuire Granules

/XIANG Cai-qin1, FENG Jian-an2, LI Xi2, HUANG Yan2, ZHOU Fang1//(1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610072, Sichuan;2.Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine Sciences, Institute of TCM, Chengdu 610031, Sichuan.)

Objective:To study the quality standard of Jiedu Tuire Granules.Method:The pharmacological properties of Huangqin, Gegen, Chonglou and Qinghao were identified by thin layer chromatography. The main active ingredient baicalin was quantitatively identified by high performance liquid chromatography (HPLC).Result:Thin layer chromatography showed that the granules were stained with the same color spots or fl uorescent spots in the same position as Huangqin and Chonglou etc.The results showed that the linearity was good in the range of 0.0118 ～ 0.118 mg⋅mL-1. The average recovery was 100.24%.Conclusion:The method is specific, stable, reliable and reproducible. And it can be used to control the quality of Jiedu Tuire Granules.

Jiedu Tuire Granules; quality standard; thin layer chromatography; high performance liquid chromatography

R 283.6

A

1674-926X(2017)06-010-04

四川省科研院所科技成果转化资金(项目编号：14010138)

1.成都中医药大学，四川 成都 610072；2.四川省中医药科学院中医研究所，四川 成都 610031

向采芹，女，1992年出生，硕士研究生，研究方向：中药新剂型，新技术，新工艺的研究Tel∶15809299482 Email∶742426178@qq.com

李希，女，1969年出生，，硕士，教授，研究方向：中药新剂型，新技术，新工艺的研究Tel∶13608170046 Email∶1836820767@qq.com

2017-04-24

(责任编辑：傅舒)