天浆壳多酚的提取工艺优化及其抗氧化活性评价

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(1.锦州医科大学附属第一医院,辽宁锦州 121000;2.93263部队医院,辽宁锦州 121000;3.锦州医科大学,辽宁锦州 121000)

天浆壳多酚的提取工艺优化及其抗氧化活性评价

崔錾1,吕芳2,王天一3,张富强3,郭斌1,*,韩冠英1,李敏3,白雨鑫1

(1.锦州医科大学附属第一医院,辽宁锦州 121000;2.93263部队医院,辽宁锦州 121000;3.锦州医科大学,辽宁锦州 121000)

目的:确定天浆壳多酚的最佳提取工艺,并对其抗氧化活性进行初步研究。方法:以多酚提取量为指标,在单因素实验基础上,采用响应面法优化天浆壳多酚提取工艺。通过多酚的还原能力、羟自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)自由基的清除作用来评价其抗氧化活性。结果:天浆壳多酚最佳提取工艺:乙醇浓度(v/v)为42%,液料比为16∶1 (mL/g),提取温度为61 ℃,超声时间为64 min。在此条件下,天浆壳多酚的提取量为(26.86±0.37) mg/10 g。该多酚具有一定的还原能力,当多酚浓度为1 mg/mL时,对羟自由基和DPPH·自由基清除率分别为70.78%和85.22%。结论:此优化工艺可行,该多酚具有一定的抗氧化能力。

天浆壳,多酚,响应面法,抗氧化活性

天浆壳为萝藦科萝藦属植物萝藦的果壳。萝藦为多年生缠绕草本,在中国分布广泛,且在日本、朝鲜和俄罗斯亦有分布。其果壳在中药中被称作“天浆壳”,具有补虚助阳,止咳化痰之功效。目前对天浆壳成分的研究主要集中在多糖方面[1-2],杨蕾[3]通过对萝藦藤的定性实验,确定萝藦中含有酚类物质,但并未对萝藦果壳中酚类物质进行进一步研究。研究表明植物多酚具有多种生理活性和药用价值,其功能活性表现在抗氧化、抗辐射、抗诱变以及抗肿瘤等多个方面[4]。

目前,常见的植物多酚提取方法有溶剂萃取法、超临界流体萃取法、微波浸提法和超声波辅助提取法。其中溶剂萃取法虽然操作简单,但其使用的有机试剂易燃,且部分有毒,对安全生产十分不利[5];超临界流体萃取法采用超临界CO2为萃取剂,可以避免使用有毒有机溶剂,且无环境污染,产品分离时简单方便,但需一次性投入较多的资金[6];微波浸提只适合短时间内快速提取,长时间提取可能会导致提取液温度过高使多酚类物质分解,提取量减少[7]。超声波辅助提取法以其浸提时间短、提取率高及操作简便、对环境无污染等优点,被广泛应用于多种植物多酚的提取研究中[8],如安化黑茶[9]、石榴皮[10]、牡丹籽[11]、枣皮[12]、及蒲公英[13]等的多酚提取。本研究以超声辅助提取为前提,并在单因素实验的基础上,采用响应面法来研究天浆壳中多酚提取的最佳条件,并通过体外抗氧化实验对其药理活性进行初步评价,为进一步研究天浆壳多酚抗氧化活性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

天浆壳 采摘于辽宁省锦州市周边,经辽宁省锦州市药品检验所翟铁红主任药师鉴定为天浆壳;没食子酸、福林酚试剂 均购自上海源叶生物科技有限公司;抗坏血酸(VC) 购自国药集团;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·) 购自美国Sigma公司;其他试剂 均为国产分析纯。

L5S紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;SCIENTZ-10N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;RE-3000旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;UP3200HE数控超声波清洗器 南京垒君达超声电子设备有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 天浆壳多酚的提取 将天浆壳烘干、粉粹,过40目筛。称取10.0 g天浆壳粉于500 mL锥形瓶中,将一定浓度的乙醇溶液,按照不同的液料比加入瓶中,搅拌均匀,封口,置于超声仪中,超声功率设定为100 W,在一定温度下超声提取一定时间后,过滤,得多酚提取液。

1.2.2 天浆壳多酚的提取量测定 标准曲线的绘制根据福林酚法[14],以没食子酸为标准品,以其浓度为横坐标,765 nm波长下的吸光度为纵坐标,所得回归方程为:A=0.00882C+0.0814(R2=0.9989),线性范围:20～100 μg/mL。提取量表达式:M=(10×C×V)/M0。其中M为提取量(mg/10 g);C为浓度(mg/mL);V为溶液体积(mL);M0:为原料质量(g)。多酚提取液按照上述方法测定吸光度并根据回归方程计算多酚提取量,每组测定3次,取平均值。

1.2.3 单因素实验设计 采用1.2.1中提到的方法,在液料比10∶1 (mL/g),超声时间60 min,温度60 ℃的条件下,考察乙醇浓度(25%、35%、45%、55%、65%、75%,v/v)对天浆壳多酚提取量的影响;在乙醇浓度(v/v)55%,超声时间60 min,温度60 ℃的条件下,考察液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)对天浆壳多酚提取量的影响;在液料比10∶1 (mL/g),乙醇浓度(v/v)55%,超声时间60 min的条件下,考察温度(30、40、50、60、70、80 ℃)对天浆壳多酚提取量的影响;在液料比10∶1 (mL/g),乙醇浓度(v/v)55%,温度60 ℃的条件下,考察不同时间(15、30、45、60、75、90 min)对天浆壳多酚提取含量的影响。进行单因素实验,分析各因素对天浆壳多酚提取量(mg/10 g)的影响。

1.2.4 Box-Benhnken中心组合实验设计 以单因素实验结果为基础,根据Box-Benhnken实验设计原理,以天浆壳多酚提取量作为响应值,选取单因素实验中的四个因素:A(乙醇浓度)、B(料液比)、C(温度)和D(超声时间),建立四因素三水平的响应面优化实验,每组平行测定3次,取平均值。设计因素及水平见表1。

表1 响应面实验因素及水平

1.2.5 天浆壳多酚的体外抗氧化活性实验

1.2.5.1 总还原能力测定 参考文献[15],在1 mL不同浓度的样品溶液中,分别加入2 mL磷酸缓冲盐溶液(0.2 mol/L,pH6.6)和2.5 mL的1%铁氰化钾溶液,充分混匀后,在50 ℃下水浴反应20 min,冷却后,向各个反应液中加入10%三氯乙酸2 mL终止反应并离心。取2.5 mL上清液与等体积蒸馏水混匀后,加入0.5 mL的0.1%三氯化铁溶液,充分混匀,室温下反应10 min,在700 nm波长下测吸光度,用VC作为阳性对照,每组实验平行进行3次。

1.2.5.2 清除羟自由基测定 参考文献[16],在1 mL不同浓度的样品溶液中,分别加入1 mL FeSO4溶液(2 mmol/L),1 mL水杨酸乙醇溶液(2 mmol/L),1 mL H2O2(2 mmol/L)溶液,充分振荡后,在37 ℃下水浴反应30 min后,在510 nm波长下测吸光度,用VC作为阳性对照,每组实验平行进行3次,并计算羟自由基的清除率。清除率计算公式:

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100

其中，A0为1 mL蒸馏水与反应试剂的吸光度;A1为样品或VC与反应试剂的吸光度;A2为样品或VC反应液不加入H2O2的吸光度(H2O2以等体积蒸馏水代替)。

1.2.5.3 清除DPPH·测定 参考文献[17],在2 mL不同浓度的样品溶液中,加入等体积的DPPH·乙醇溶液(0.1 mmol/L),混合均匀,置于37 ℃水浴条件下反应30 min后,在517 nm波长下测吸光度。用VC作为阳性对照,每组实验平行进行3次,并计算DPPH·的清除率。清除率计算公式:

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100

其中，A0为2 mL蒸馏水加入DPPH·乙醇溶液的吸光度;A1为样品/VC反应液中加入DPPH乙醇溶液的吸光度;A2为样品/VC反应液不加入DPPH·乙醇溶液的吸光度(DPPH·乙醇溶液以等体积乙醇代替)。

1.3数据处理

实验数据应用Origin 8.0软件作图;Design-Expert 8.0.6软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1单因素实验结果

2.1.1 乙醇浓度对多酚提取量的影响 所得结果见图1。根据图1结果可知,在其它提取条件不变的情况下,在乙醇浓度小于45%时，多酚提取量随着乙醇浓度的升高而增加,这可能是因为当有机溶剂的体积分数较低时,不能破坏多酚与多糖、蛋白质等有机物质之间的氢键和疏水作用力,不利于多酚提取。当乙醇浓度升高到45%后,其提取量随着乙醇浓度的升高而减少,这是由于天浆壳中的色素,醇溶性物质等成分的溶出量增加,这些成分与多酚类化合物竞争同乙醇-水分子结合,同时天浆壳组织中的通透性下降,从而导致多酚的提取率下降[18]。因此,选择乙醇浓度为45%。

图1 乙醇浓度对多酚提取量的影响

2.1.2 液料比对多酚提取量的影响 所得结果见图2,在其它提取条件不变的情况下,多酚提取量随着所加提取溶剂体积的增加而逐渐升高,这是因为在一定范围内增加液料比有利于增大浸提物与溶剂的接触面积,使多酚充分溶出,从而提高萃取效率。当液料比达到15∶1 (mL/g)时,多酚提取量达到最高,液料比继续增加多酚提取量趋于稳定,可能是因为接触面积相对饱和,此时再增加溶剂体积对多酚提取量影响不大[19]。液料比越大,溶剂消耗越多。因此,选择液料比15∶1 (mL/g)为宜。

图2 液料比对多酚提取量的影响

2.1.3 温度对多酚提取量的影响 所得结果见图3,在其它提取条件不变的情况下,多酚提取量随着提取温度的升高而增加,当温度达到60 ℃,多酚提取量达到最高,温度继续上升时,其含量有所下降,原因可能是多酚化合物随着温度的升高有部分不稳定结构受到破坏[20]。故选择提取温度60 ℃为宜。

图3 提取温度对多酚提取量的影响

2.1.4 超声时间对多酚提取量的影响 所得结果见图4,在其它提取条件不变的情况下,多酚提取量随着超声时间的延长而增加,当超声时间达到60 min时,继续延长超声时间,其含量有所下降,原因可能是较长时间的超声作用会增加杂质的溶出,破坏多酚结构[21]。故选择超声时间为60 min。

图4 提取时间对多酚提取量的影响

2.2BBD实验结果

2.2.1 BBD实验设计方案及结果 响应面实验方案及多酚提取量的响应值见表2。

表2 响应面设计方案及结果

表3 回归模型方差分析

注:**p<0.01为极显著;*p<0.05为显著。2.2.2 回归方程拟合及方差分析 由Design Expert 8.0.6统计软件对表2数据进行回归分析,所得回归方程:M=26.23-2.39A+0.47B+0.14C+0.66D-0.23AB+0.24AC+0.50AD+0.54BC-0.11BD-0.060CD-3.49 A2-1.01B2-1.19C2-0.86D2

2.2.3 响应面图分析 根据实验所得的AD和BC的响应面曲线图(见图5),显示响应曲面陡峭,说明交互作用显著,这与方差分析结果一致。当液料比和提取温度固定时,乙醇浓度变化曲面比提取时间的变化曲面陡峭。表明乙醇浓度变化对多酚提取量的影响比提取时间大。当乙醇浓度和提取时间固定时,液料比曲面变化比提取温度变化大,表明料液比的变化对多酚提取量的影响比温度大。

图5 AD、BC对多酚提取量影响的响应面图

2.2.4 最佳提取条件的确定及验证实验 通过软件分析,得出最佳提取工艺条件为:在超声功率固定为100 W的前提下,乙醇浓度(v/v)为41.69%,液料比为16.4∶1 (mL/g),提取温度为60.85 ℃,超声时间为63.97 min,最大提取量为26.79 mg/10 g。但考虑到具体操作的方便与可行性,将最佳提取工艺条件确定为:乙醇浓度(v/v)为42%,液料比为16∶1 (mL/g),提取温度为61 ℃,超声时间为64 min,在此最佳提取工艺条件下,进行3次验证实验,平均提取量为(26.86±0.37) mg/10 g。由此可知响应面法建立的回归模型可靠,最佳提取工艺可行。将此条件下所得的多酚提取液进行浓缩、冷冻干燥,得多酚固体,备用。

2.3天浆壳多酚的体外抗氧化活性

2.3.1 总还原能力实验结果 铁氰化钾可在酸性条件下与Fe3+反应,生成有色物质,在700 nm处具有特征吸收,且浓度越大,其吸光值越大,即还原能力越强。图6表明,天浆壳多酚具有一定的还原能力,且还原能力随着多酚浓度的升高而增强,呈现出浓度依赖性,但清除能力弱于VC。

图6 多酚总还原能力

2.3.2 清除羟自由基实验结果 图7表明,多酚清除羟自由的能力随着多酚浓度的升高而增强,呈现出浓度依赖性,当多酚浓度到达1 mg/mL时,其清除率可达70.78%,IC50(半抑制浓度)为0.61 mg/mL,说明天浆壳多酚对羟自由基具有一定的清除能力,但清除能力弱于VC。

图7 多酚对羟自由基的清除能力

2.3.3 清除DPPH·实验结果 可以通过记录DPPH·在517 nm处的吸光度值变化来评价抗氧化物质的抗氧化能力强弱。图8表明,清除能力随着浓度的升高而增强,呈现出浓度依赖性,浓度到达1 mg/mL时,其清除率可达到85.22%,IC50(半抑制浓度)为0.37 mg/mL,但清除能力较VC稍弱。说明天浆壳多酚对DPPH·具有一定的清除能力。

图8 多酚对DPPH·的清除能力

3 结论与讨论

本研究在单因素的基础上,采用响应面分析法对天浆壳多酚的提取工艺进行了优化,确定天浆壳多酚最佳提取工艺为:乙醇浓度(v/v)为42%,液料比为16∶1 (mL/g),提取温度为61 ℃,超声时间为64 min,在此条件下多酚提取量可达到(26.86±0.37) mg/10 g。乙醇浓度、液料比及超声时间对多酚提取含量有显著影响,温度影响不显著,影响大小顺序为:乙醇浓度>超声时间>液料比>提取温度。

机体内的羟自由基是直接或间接导致组织损伤的一种重要活性氧自由基。研究表明,人体内的羟自由基的存在可以引发人体内的多种疾病,促进人体衰老[22]。DPPH·清除率测定法广泛用于定量测定生物试样和食品的抗氧化能力[23]。通过对天浆壳多酚清除羟自由基和DPPH·的能力评价,表明天浆壳多酚具有一定的抗氧化能力,且其抗氧化能力呈现浓度依赖性,此外该多酚还具有一定的还原能力。植物来源的抗氧化活性成分研究遍及医药及功能食品等方面[24],本研究中的天浆壳多酚为开发利用功能保健食品提供了一定的理论依据。

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OptimizationofextractionprocessofpolyphenolsfromfruitshellofMetaplexisjaponica(Thunb.)Makinoandevaluationofitsantioxidantactivity

CUIZan1,LVFang2,WANGTian-yi3,ZHANGFu-qiang3,GUOBin1,*,HANGuan-ying1,LIMin3,BAIYu-xin1

(1.Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China;2.93263 Military Hospital,Jinzhou 121000,China;3.Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China)

Objective:To determine the optimum extraction process of polyphenols from fruit shell ofMetaplexisjaponica(Thunb.)Makino and preliminarily evaluate its antioxidant activity. Method:On the basis of single factor experiments,the extraction conditions of polyphenols were optimized by response surface methodology with the content of polyphenols as index. The antioxidant capacity was measured by reducing power,scavenging of hydroxyl radicals and DPPH. Result:The optimum extraction conditions were as follows:ethanol concentration(v/v)was 42%,ratio of liquid to solid was 16∶1 (mL/g),extraction temperature was 61 ℃ and extraction time was 64 min. Under the conditions,the extraction amount of polyphenols was(26.86±0.37)mg/10 g. The polyphenols had certain reducing power. When the concentration of polyphenols was 1 mg/mL,the clearance rate on hydroxyl radicals and DPPH· was 70.78% and 85.22%,respectively. Conclusion:The optimized technology was feasible and the polyphenols had certain antioxidant capacity.

shell ofMetaplexisjaponica(Thunb.)Makino;polyphenols;response surface methodology;antioxidant activity

2017-04-21

崔錾(1986-)，男，硕士，药师，主要从事植物有效成分方面的研究，E-mail:jycuizan@hotmail.com。

*

郭斌(1969-)，男，博士，教授，主要从事天然产物有效成分方面的研究，E-mail:lyguobin@hotmail.com。

国家自然科学基金项目(81302681)；国家科技型中小企业技术创新基金项目(14C26242100741)；辽宁省大学生创新训练项目(201510160000004；201510160000016)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)22-0167-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.033