响应面法优化白玉菇多糖的提取工艺

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(临沂大学药学院,山东临沂 276000)

响应面法优化白玉菇多糖的提取工艺

霍宗庆,徐婉晴,刘言娟*

(临沂大学药学院,山东临沂 276000)

为优化白玉菇多糖的提取工艺,选取提取温度、提取时间以及水料比(mL/g)为因素,进行单因素实验。并在此基础上,通过响应面法建立数学模型,进行数据分析,对白玉菇多糖提取工艺的各因素进行优化及验证。最终确定最佳工艺条件为:提取温度80 ℃、提取时间4.2 h、水料比(mL/g)35∶1，白玉菇多糖的平均得率为6.41%。

白玉菇,多糖,响应面法,工艺优化

白玉菇(white hypsizygus marmoreus)又名白玉蕈,为真姬菇的一个变种,隶属担子菌亚门(Basidiomvcotina)、层菌纲(Hvmenomvcetes)、伞菌目(Agaicales)、白蘑科(Tricholomataceae)、玉蕈属(Hypsizigus)[1-2],富含氨基酸和丰富的维生素以及矿物质等营养成分[3]。已有研究结果表明,白玉菇的菌丝体和热水浸提物均具有明显的抗氧化活性[4],并且其实体和菌丝体中总糖和多元醇的含量明显高于普通真姬菇中的含量[5]。王耀松等[6]的研究发现,白玉菇子实体中营养成分齐全,其中粗蛋白、粗脂肪和粗纤维含量较真姬菇稍低,矿物元素、维生素以及氨基酸含量和种类与真姬菇相当且均较丰富,但是多糖的含量明显高于真姬菇,而真菌多糖是食用菌最重要的组分之一,具有多种生物活性,包括抗氧化[7]、抗肿瘤[8]、抗辐射[9]、抗炎[10-11]、降血糖血脂[12-15]和免疫调节功能[16]等。因此,白玉菇作为食品、药品原料,具有潜在的开发利用前景。

有研究发现白玉菇多糖对白色念珠菌和产气杆菌有较强的抑制作用[17],另外,白玉菇多糖还具有增强免疫功能、止咳化痰、通便排毒、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等多种生物活性,经常食用会改善人体的新陈代谢,降低胆固醇含量。本研究拟采用操作简单并且经济的热水浸提法对白玉菇多糖进行提取,采用Design-Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken设计实验对提取工艺进行优化,以确定白玉菇多糖水提醇沉的最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

白玉菇 山东省临沂市某市场;硫酸 分析纯,南京化学试剂有限公司;苯酚 分析纯,广东汕头市西陇化工厂;无水乙醇 分析纯，天津恒兴化学试剂制造有限公司;葡糖糖标准品 大连美仑生物技术有限公司;本实验用水 均为蒸馏水。

DF-1型集热式磁力搅拌器 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂;DHG-9035A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司;RE-52A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;LD5-2B低速离心机 北京雷勃尔离心机有限公司;TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;ME104E电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;DZF-6050真空干燥箱 上海风棱实验设备有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 白玉菇多糖的提取工艺 将新鲜白玉菇放在45 ℃真空干燥箱中烘干至恒定质量→粉碎机粉碎后过60目筛→白玉菇干粉→热水浸提→低速离心(4000 r/min)20 min→取上清液→浓缩至原体积1/5→4倍量乙醇沉淀→过夜→滤液离心→沉淀物→真空干燥→白玉菇多糖粗品粉末。

1.2.2 多糖含量的测定

1.2.2.1 标准曲线的绘制 本研究采用苯酚-硫酸法[18]对白玉菇多糖含量进行测定。精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品10.0 mg,蒸馏水定容至100 mL,备用。分别取上述储备液0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL到对应编号的试管中,分别加蒸馏水补至2.0 mL,得到浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04和0.05 mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别向上述各试管中加入1.0 mL 6%苯酚、5.0 mL浓硫酸,摇匀,沸水浴30 min,之后冷却至室温,待测。空白对照采用2.0 mL蒸馏水、1.0 mL 6%苯酚、5.0 mL浓硫酸进行配制,于490 nm处测定吸光度。以标准溶液浓度(X)为横坐标,吸光度(Y)为纵坐标绘制标准曲线,所得标准曲线回归方程为:Y=15.57X-0.0263(R2=0.9991)。

1.2.2.2 白玉菇多糖含量的测定 精密称取1.2.1中的多糖粉末10.0 mg,加水定容至100 mL,取2.0 mL加入试管中。按1.2.2.1中的方法进行操作,在490 nm处测定样品溶液的吸光度。将所测吸光度值带入1.2.2.1的回归方程中计算得样品溶液中多糖的浓度。

1.2.3 白玉菇多糖得率的计算

多糖得率(%)=(多糖的浓度×溶液的体积×稀释倍数)÷白玉菇干重×100

1.2.4 单因素实验 以白玉菇多糖的得率为考察指标,分别考察提取温度、提取时间和水料比对白玉菇多糖得率的影响。每个实验平行做3次,取平均值。

1.2.4.1 提取温度对多糖得率的影响 在提取时间3 h,水料比(mL/g)20∶1的条件下,分别选取50、60、70、80和90 ℃为提取温度进行实验,以考察提取温度对多糖得率的影响。

1.2.4.2 提取时间对多糖得率的影响 以1.2.4.1中筛选出的最佳提取温度(80 ℃)和水料比20∶1 (mL/g)为实验条件,分别选取1、2、3、4、5 h为提取时间进行实验,以考察提取时间对多糖得率的影响。

1.2.4.3 水料比对多糖得率的影响 以1.2.4.1和1.2.4.2中筛选出的最佳提取温度(80 ℃)和最佳提取时间(4 h)为实验条件,分别选取10∶1、20∶1、30∶1、40∶1和50∶1为提取时的水料比(mL/g)进行实验,以考察水料比对多糖得率的影响。

1.2.5 响应面实验的设计 在筛选出的最佳单因素条件的基础上,以多糖得率为响应值,使用Design-Expert 8.0.6软件,进行Box-Behnken实验设计,实验设计各因子编码水平如表1所示。

表1 Box-Behnken实验因素与水平

1.3数据的处理

使用Design-Expert 8.0.6软件的数据处理系统,完成数学回归模型的建立、显著性分析、响应曲面分析。

2 结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1 提取温度对多糖得率的影响 如图1所示,在50～80 ℃的区间内,白玉菇多糖得率随提取温度的升高而增大,在80 ℃时,多糖得率达到最大值,再继续升高温度时多糖得率开始下降。可能是由于温度过高会导致多糖结构破坏,发生降解,使得多糖得率降低[19-20],因此选择提取温度为80 ℃。

图1 提取温度对多糖得率的影响

2.1.2 提取时间对多糖得率的影响 如图2所示,提取时间为1～4 h时,多糖得率随提取时间的延长增加较为明显,超过4 h以后多糖得率变化趋于平缓甚至有降低趋势。4 h时多糖得率最大,故选4 h为最佳提取时间。多糖从白玉菇粉末扩散到溶剂中需要一定时间,提取开始时,多糖在水中的浓度很低,在一定的时间内白玉菇中的多糖可以快速地释放到提取溶剂中,时间越长释放到溶剂中的多糖量越多[19]。但随着时间的延长,一方面,溶剂中的多糖含量不断升高,溶液趋于饱和状态,使得多糖的释放量减少,多糖得率增幅减小;另外,白玉菇中的糖蛋白可能因提取时间过长而变性,沉淀析出,使得多糖的得率下降。

图2 提取时间对多糖得率的影响

2.1.3 提取水料比(mL/g)对多糖得率的影响 如图3所示,在水料比(mL/g)小于30∶1时,多糖得率随水料比的增大而呈上升趋势,之后开始下降,30∶1是白玉菇多糖得率最高的水料比(mL/g)。在提取过程中,水料比(mL/g)对得率的影响可以解释为:溶剂量的增加使物料与溶剂接触面积、溶液传质推动力均增大,浓度梯度变大,有利于多糖的溶出,从而使其溶出速度和得率变大,当水料比(mL/g)一定时,得率最高;随着水料比(mL/g)的继续增加,溶剂体积增加使得物料吸附溶剂的量也逐渐变大,从而导致多糖被物料吸附而不易溶出[21]。因此,本研究选择30∶1为最佳提取水料比(mL/g)。

表3 模型方差分析结果

图3 提取水料比对多糖得率的影响

2.2响应面实验

2.2.1 实验设计方案及结果 响应面实验设计及结果如表2所示。

表2 Box-Behnken实验设计方案及响应值

2.2.2 回归模型的建立及方差分析 使用Box-Behnken设计模型数据分析系统中的ANOVA进行回归分析,并进行显著性检验,建立回归模型。模型方差分析结果如表3所示。

通过BBD模型分析,建立的模型回归方程:

Y=-129.74375+3.01287A+6.77750B-0.001375C-0.040250AB+0.0026AC-0.014250BC-0.018150A2-0.35250B2-0.002050C2。

2.2.3 响应面分析 响应曲面的陡峭程度反映交互作用的显著程度,曲面越陡峭,显著程度越高,陡峭程度越小,则表示交互作用显著程度越低[22]。等高线的形状也反应交互作用的强弱,等高线越接近于圆形,显著程度越弱,形状越接近于椭圆形,则表示交互作用越显著[23]。各因素之间的交互影响直观效果如图4～图6所示。

如图4所示,曲面陡峭,说明提取时间和提取温度的交互作用显著,多糖得率随温度和时间的递增先增加后减少。由图4中的等高线可知,等高线的椭圆程度较高,也显示提取时间和提取温度交互作用显著,等高线集中在提取时间一侧,表明提取时间对于多糖得率的影响大于提取温度。

图4 提取时间和提取温度对多糖得率的交互作用响应面图

由响应面图5所示,曲面平缓,说明水料比和提取温度的交互作用不显著,多糖得率随温度和水料比的递增先增加后减少。由图中的等高线可知,等高线的椭圆程度不高且等高线稀疏,也显示两者交互作用不显著,等高线集中在水料比一侧,表明水料比对于多糖得率的影响大于提取温度的影响。

图5 水料比和提取温度对多糖得率的交互作用响应曲面图

由响应面图6所示,曲面平缓,说明水料比和提取时间的交互作用不显著,多糖得率随时间和水料比的变化不明显。从其中的等高线可知,等高线形状的椭圆程度不大,也显示两者交互作用不明显。

图6 提取时间和水料比对多糖得率的交互作用响应面图

2.2.4 最佳工艺条件的确定 通过Design-Expert 8.0.6软件,依照数学回归模型对数据进行优化,得出最佳工艺参数为提取温度80.85 ℃、提取时间4.27 h、水料比(mL/g)36.10∶1,多糖得率理论值为6.49%。

为验证分析结果的可行性与可靠性,选取工艺条件为提取温度80 ℃、提取时间4.2 h、水料比35∶1 (mL/g)进行验证实验,白玉菇多糖的平均得率为6.41%,接近6.49%的理论值,其相对误差为0.08%,表明该模型准确可靠。

3 结论与讨论

本文首先筛选了采用水提醇沉法提取白玉菇多糖的最佳单因素条件:提取温度、提取时间和水料比。以响应面优化的参数为指导最终确定水提醇沉法提取白玉菇多糖的最佳工艺条件为:提取温度80 ℃、提取时间4.2 h、水料比35∶1 (mL/g),在该实验条件下白玉菇多糖的平均得率为6.41%。已有研究将热水浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法和碱提法对白玉菇多糖的提取效果进行比较,结果显示4种方法提取多糖的得率分别为2.90%、5.48%、4.86%、4.71%[24],均低于本研究中多糖的得率。王孟楚等优化超声波辅助提取白玉菇多糖的各项参数,最终经实验验证利用最优工艺路线所得多糖得率为7.79%[25]。虽然该工艺路线对多糖的得率比本研究中的高,但是本研究的能耗和成本相对较低,更有利于工业化生产。本文将为白玉菇多糖的进一步研究与开发应用提供一定的理论依据和技术支撑。

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Optimizationoftheextractiontechnologyofpolysaccharideinwhitehypsizygusmarmoreusbyresponsesurfacemethodology

HUOZong-qing,XUWan-qing,LIUYan-juan*

(School of Pharmacy,Linyi University,Linyi 276000,China)

In order to optimize the extraction process of white hypsizygus marmoreus polysaccharide,the single-factor experiments were carried out with extraction temperature,extraction time and ratios of water to material as single factors. On the basis of single-factor experiments,response surface methodology was employed to establish mathematic model,analyze experimental data,optimize and verify the extraction process parameters of white mushroom polysaccharide. The results of optimum extraction conditions were as follows:extraction temperature 80 ℃,extraction time 4.2 h and ratio of water to raw material 35∶1 (mL/g). Under these conditions,the average extraction yield was 6.41%.

white hypsizygus marmoreus;polysaccharide;response surface methodology;process optimization

2017-04-25

霍宗庆(1994-)，男，大学本科，研究方向：天然产物的分离与纯化，E-mail:1043119507@qq.com。

*

刘言娟(1985-)，女，博士研究生，研究方向：天然产物的色谱分离与分析，E-mail:liuyanjuan09@163.com。

临沂大学博士科研启动经费(LYDX2016BS050)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)22-0145-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.029