虾青素对秀丽隐杆线虫衰老的改善作用及机制研究

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(北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083)

虾青素对秀丽隐杆线虫衰老的改善作用及机制研究

罗婧,沈紫龙,任建武*

(北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083)

通过寿命实验、氧化应激、热应激实验研究虾青素(Astaxanthin)对秀丽隐杆线虫衰老和急性应激效应的改善作用并探究其作用机制。秀丽隐杆线虫分为对照组和虾青素处理组(0.8、1.2和1.6 mmol/L),首先研究不同浓度虾青素对野生型线虫寿命的影响,通过平均与最大寿命确定作用的最佳剂量;选用最佳剂量的虾青素作用于野生型和突变株线虫,采用热应激和氧化应激实验研究其可能机制。结果表明:与对照组相比,采用1.2 mmol/L虾青素饲喂秀丽隐杆线虫,野生型线虫平均寿命延长了41.79%(p<0.01),最大寿命延长了32.72%(p<0.01)。热应激及氧化应激实验中,采用1.2 mmol/L虾青素饲喂秀丽隐杆线虫,野生型线虫平均生存时间分别延长了22.54%和24.23%(p<0.01)。1.2 mmol/L虾青素可显著提高sir-2.1突变株线虫的存活时间,但对daf-2、daf-16和eat-2突变株线虫均无显著影响。综上所述,浓度为1.2 mmol/L的虾青素可显著延长野生型线虫的平均寿命和最大寿命,并显著延长其在氧化应激及热应激条件下的平均生存时间和最大生存时间。虾青素延长线虫寿命的功效可能是通过提高线虫的在热及氧化恶劣环境下的耐受能力而实现的,其作用机制可能与胰岛素信号通路及能量限制通路有关。

虾青素,秀丽隐杆线虫,衰老

衰老是一种普遍存在的、复杂多变的生物学过程。伴随衰老进程,细胞和组织发生多种病理变化,极易引发阿尔兹海默病、帕金森病、心脑血管病等衰老相关疾病[1-2],给家庭和社会造成了巨大的负担。我国人口老龄化趋势逐渐加剧,各种老年性疾病问题逐渐凸显,目前亟需开展衰老相关的研究工作,寻求抗衰老的策略。

虾青素(Astaxanthin)是一种类胡萝卜素,广泛存在于虾蟹外壳及雨生红球藻中[3-4]。研究证实,虾青素具有抗氧化、增强人体免疫力、抗肿瘤、防治糖尿病、抗炎、保护心脑血管、维护中枢神经系统等多种活性功能[5-8]。目前,有关虾青素延缓衰老的研究备受关注,虾青素抗衰老的作用机制需进一步明确。

因具有繁殖快、易培养、生命周期短、基因调控简单、进化高度保守等特点[9],秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)被用作一种模式生物,广泛用于衰老、神经发育毒性和免疫等方面的研究[10-11]。线虫具有与哺乳动物同源的抗胁迫机制和相关基因,被广泛应用于抗衰老物质的筛选和抗衰老分子机制的研究。近年来,通过遗传筛选和自然突变等方法,人们发现了多种影响衰老的基因和信号传导通路。胰岛素信号通路(insulin/IGF-1signaling pathway)是已知的调控生物体发育和衰老最重要的信号通路,具有高度保守性[12];热量限制(Caloric Restriction,CR)通路可通过热量限制,稳定地延长许多生物体寿命;饮食限制(Diet Restriction,DR)通路可导致线虫长寿,研究发现对线虫进行间歇性禁食,能使线虫寿命延长50%以上[13]。现有研究大多集中于单一信号通路探索,但药物作用于线虫可能通过多种通路联合作用,共同调节线虫的生理功能。

本研究以秀丽隐杆线虫为模式生物,评价虾青素延缓线虫衰老的作用并进一步采用突变株线虫初步探讨其功效的可能机制,以期为功能性食品及保健品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

虾青素 上海源叶生物科技有限公司;野生型(wild-type)线虫品系N2、突变株DR1572daf-2(el368)、GR1307daf-16(mgDf50)、VC199sir-2.1(ok434)、DA1116eat-2(ad1116)、线虫的食物大肠杆菌(EscherichiacoliOP50) 均由北京市疾病预防控制中心提供;二甲基亚砜、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、氯化钙、胆固醇、无水乙醇、次氯酸钠(4%)、氢氧化钠、75%医用消毒酒精 国药集团化学试剂有限公司;琼脂粉、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物 BD公司;百草枯(甲基紫精)、2′-Deoxy-5-fluorouridine,Flourridine(5-氟脱氧尿苷,FuDR) 美国SIGMA公司。

H/T16MM型台式高速离心机 湖南赫西仪器装备有限公司;5930型高速离心机 日本三洋公司;HP250S型生化培养箱 武汉瑞华仪器设备有限责任公司,Vartev Gemie2型漩涡振荡仪 美国Vortek公司;ZWY-211B型温培养振荡仪 上海智城分析仪器制造有限公司;SZ51型体式显微镜 日本OLYMPUS公司;HPG-280H型人工气候箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 线虫的培养 将雌雄同体线虫饲养于涂布大肠杆菌OP50(E.coliOP50)的线虫标准培养基(Nematode growth medium,NGM)上,培养温度20 ℃,观察线虫生长情况,定期将线虫转至新的涂有E.coliOP50的NGM培养基中。

1.2.2 秀丽隐杆线虫的同步化 Bleach液漂白法:取出处于产卵高峰期的线虫NGM板,切除一小块用于传代(或挑取传代),将剩余的腹内含卵线虫用1～2 mL的S-basal缓冲液冲洗下来,至15 mL离心管中,静置2 min,待线虫沉入底部,吸取上层清液,加入5～7 mL线虫裂解液Bleach液,漩涡振荡仪振荡裂解5～8 min,20 ℃离心3 min(3000 r/min),用S-basal缓冲液清洗3次,最后加入3～5 mL S-basal液,放置于20 ℃恒温摇床(100 r/min)培养12 h,取出后可放置于15 ℃恒温箱中保存一周的时间,便于实验的处理以及消除个体不同差异带来的实验误差。

1.2.3 线虫寿命实验 将虾青素用0.2%二甲基亚砜溶液溶解,配制成8 mmol/L的贮存液,细菌过滤器过滤除菌,备用。实验设定无虾青素对照组和虾青素低、中、高剂量组。将虾青素贮存液加入到含FuDR(终浓度为50 mg/mL)的NGM培养基中(抑制线虫后代生长,保证同步化),使其终浓度分别为0.8、1.2和1.6 mmol/L,观察在添加虾青素的NGM培养基中野生型线虫的生长发育情况,每组挑取60只young adult时期线虫,每组3个平行,每个平行20只线虫。每天在显微镜下观察线虫,记录线虫生存、死亡以及爬出培养皿壁自然丢失的线虫的数目。死亡判断标准:对机械刺激无任何反应即视为死亡。

1.2.4 急性热应激实验 将线虫进行同步化处理后置于20 ℃培养,每2 d将线虫转移到新的含有1.2 mmol/L虾青素的NGM板中,在成虫期的第5 d,将线虫转至35 ℃空白NGM板中进行培养,每2 h计数一次至全部死亡,计数线虫死亡、存活的数目,计算线虫在35 ℃时的热应激存活率(在高温条件下,爬培养皿壁上和钻入培养基中的线虫不计入统计的总数)。每组3个平行,每个平行20只线虫。

1.2.5 急性氧化应激实验 将线虫进行同步化处理后置于20 ℃培养,每2 d将线虫转移到新的含有虾青素(终浓度1.2 mmol/L)的NGM板中。在成虫期的第5 d,将线虫转至20 ℃ 24孔板中进行培养,每2 h计数一次至全部死亡。24孔板中每孔加入200 μL百草枯溶液(300 mmol/L,溶解于S-media溶液),每四个孔为一组,每孔15只线虫。统计线虫在氧化应激条件下的存活率。

1.3统计学方法

实验均重复3次,数据采用SPSS Statistics 20.0进行统计分析,以平均值±标准差表示,组间比较采用ANOVA分析,“*”表示p<0.05,“**”表示p<0.01，两者均为差异有统计学意义。平均值为具有统计意义的线虫整体存活时间的平均值,最大值为抵抗胁迫能力最强的整体的10%存活时间的平均值。

2 结果与讨论

2.1不同浓度虾青素对野生型线虫寿命的影响

如图1所示,与对照组相比,采用终浓度分别为0.8、1.2和1.6 mmol/L的虾青素饲喂后,线虫生存曲线右移,其中当浓度为1.2 mmol/L时,虾青素延长线虫寿命效果最显著。

表1 不同浓度虾青素对线虫寿命的影响

图1 不同浓度虾青素对线虫存活率的影响

注:与对照组相比,*：p<0.05,**：p<0.01;表2、表3同。

如表1所示,对照组线虫的平均寿命为15.7 d,最大寿命为22.0 d。采用终浓度分别为0.8、1.2和1.6 mmol/L的虾青素饲喂后,线虫的平均寿命和最大寿命均显著延长(p<0.01),且当处理浓度为1.2 mmol/L时效果最为显著,平均寿命和最大寿命比对照组分别提高41.79%和32.72%(p<0.01)。

2.2虾青素对野生型及突变株线虫热应激耐受能力的影响

在成虫的第5 d,将线虫转至35 ℃空白NGM板中培养,饲喂虾青素组野生型线虫N2,sir-2.1的生存曲线明显右移,突变株daf-2、daf-16和eat-2的生存曲线无明显变化(图2)。

表2 虾青素对线虫热应激生存时间的影响

图2 虾青素对线虫热应激存活率的影响

如表2所示,对照组野生型线虫N2的平均生存时间和最大生存时间分别为20.0 h和25.3 h。与对照组相比,饲喂1.2 mmol/L虾青素均能显著延长线虫的平均生存时间和最大生存时间,平均生存时间和最大生存时间分别提高了22.54%和23.68%(p<0.01)。虾青素能够提高sir-2.1的平均生存时间(p<0.05),但并不能提高突变株daf-2、daf-16和eat-2的生存时间,表明虾青素提高线虫的耐热能力与daf-2、daf-16和eat-2基因有关。

2.3虾青素对野生型及突变株线虫氧化应激耐受能力的影响

在成虫的第5 d,将线虫置于百草枯诱导的氧化胁迫条件下,饲喂虾青素组野生型线虫N2、sir-2.1的生存曲线明显右移,突变株daf-2、daf-16和eat-2生存曲线无明显变化(图3)。

图3 虾青素对线虫氧化应激存活率的影响

如表3所示,在百草枯诱导的氧化胁迫条件下,饲喂1.2 mmol/L虾青素能显著延长野生型线虫N2的平均生存时间和最大生存时间,平均生存时间比对照组提高24.23%(p<0.01),最大生存时间比对照组提高31.25%(p<0.01),且提高sir-2.1的生存时间(p<0.01),但并不能提高突变株daf-2、daf-16、eat-2的生存时间,这说明虾青素的抗氧化能力与daf-2、daf-16、eat-2基因有关。由此可见,在氧化应激胁迫条件下虾青素能够很好地保护秀丽隐杆线虫,缓解极端氧化应激对线虫的损伤。

表3 虾青素对突变株线虫氧化应激生存时间的影响

3 讨论与结论

生命周期与机体对外界的抵抗胁迫能力有关[14]。已有研究表明,线虫寿命与其抗胁迫能力水平有关[15],有文献报道,淫羊藿总黄酮、原花青素B2、蜜环菌菌索多糖等能够延长秀丽线虫寿命,其作用机制可能与其增强线虫应激能力有关[16-18]。本实验发现虾青素能显著提高野生型线虫的热应激和氧化应激能力,其寿命的延长可能通过提高抗胁迫能力来实现。

胰岛素信号通路是机体重要的调控通路之一,对发育、代谢、衰老的调节均起到关键作用。研究表明:Daf-2与胞外类似胰岛素配体结合后导致PI3K催化亚基同源物AGE-1活化,后者产生第二信使进一步激活下游AKT/PKB同源物丝氨酸/苏氨酸激酶AKT-1/AKT-2,磷酸化转录因子Daf-16,从而抑制其进入细胞核发挥转录调节功能[19]。Daf-16可以影响代谢调节、抗胁迫基因的表达,进而延长寿命[20]。虾青素对daf-2、daf-16突变体应激能力的改变无显著差异,表明其可能通过调节由daf-2、daf-16等基因参与的胰岛素信号通路来发挥作用。保持营养充足的情况下,减少能量摄入能延长生物体寿命,这是目前能够确定的延长生物体寿命的理论,这一理论在线虫模型中得到充分体现。因神经活肌肉受损而进食缺陷的突变体(eat-2)可以充分验证虾青素通过eat-2基因,能量限制通路起作用,而与热量限制无关(sir-2.1)。

本实验结果表明,一定浓度范围内虾青素可以延缓线虫衰老,添加浓度为1.2 mmol/L时效果最为显著,平均寿命提高41.79%,并能提高线虫的热应激能力22.54%及氧化应激能力24.23%。虾青素可能通过提高线虫在热及氧化应激条件下的耐受性来延长线虫寿命,其作用机制可能与胰岛素信号通路和能量限制通路有关。

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TheagingimprovementeffectsandmechanismofastaxanthinonCaenorhabditiselegans

LUOJing,SHENZi-long,RENJian-wu*

(College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

In this study,the mechanism of the aging improvement of astaxanthin onCaenorhabditiseleganswas studied by lifespan extension analysis,oxidative stress,and heat stress analyses. Astaxanthin-treated groups(0.8,1.2,and 1.6 mmol/L)were compared to the control group to explore the anti-aging effect of different concentrations in wild-type nematode and identify the optimal dose according to mean and maximum lifespan extension. The optimal dose of astaxanthin was 1.2 mmol/L,at which dose astaxanthin prolonged mean lifespan of wild type nematode by 41.79%(p<0.01)and increased maximum lifespan by 32.72%(p<0.01).The possible mechanisms of astaxanthin’s aging effects were further studied using the 1.2 mmol/L treatment to test its impact on resistance to heat and oxidative stress. The mean survival times of astaxanthin-treated wild type nematode after oxidative and heat stress were increased by 22.54% and 24.23%(p<0.01),respectively. In oxidative stress and heat stress experiments,1.2 mmol/L astaxanthin could significantly increase the survival time of thesir-2.1 mutant nematodes,but had no significant effect ondaf-2,daf-16,oreat-2 mutants. The above results suggested that astaxanthin can prolong the lifespan of nematodes by increasing stress tolerance and its mechanism may be related to the insulin signaling and diet-restriction pathways.

astaxanthin;Caenorhabditiselegans;aging

2017-04-25

罗婧(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：天然产物研究与开发，E-mail：18813072633@163.com。

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任建武(1967-)，男，博士，副教授，研究方向：天然产物研究与开发，E-mail：jianwur@sina.com。

TS201.1

A

1002-0306(2017)22-0022-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.005