红花羊蹄甲种子活性物质提取及其抑菌作用研究

户 勋,袁素素,叶秀娟,邹华松

(福建农林大学植物保护学院，福建福州350002)

红花羊蹄甲种子活性物质提取及其抑菌作用研究

户 勋,袁素素,叶秀娟,邹华松∗

(福建农林大学植物保护学院，福建福州350002)

为了验证红花羊蹄甲种子提取物是否有抑菌活性,通过超声波破碎提取红花羊蹄甲种子的活性物质,再由超滤离心管分离其中的蛋白。平板抑菌圈试验结果表明,该活性物质对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、番茄青枯菌、柑橘溃疡病菌和烟草野火细菌6种病原菌均有抑制作用。SDS-PAGE电泳结果表明,抑菌物质不是蛋白质组分。

红花羊蹄甲；抑菌活性；提取；植物病原菌

在药理学研究和药用价值上,羊蹄甲是一个非常好的研究对象。羊蹄甲的树皮、根、叶可做药用,具有补肾气,提神,止血,镇咳等功效,我国西南民间把羊蹄甲用于治疗糖尿病(尚小雅等,2006)。从羊蹄甲植物中分离鉴定的有效化合成分主要是黄酮类化合物。查尔酮苷和二氢黄酮苷是最早从羊蹄甲中分离得到的活性物质,随后陆续分离得到含有亚甲二氧基的黄酮类化合物,并明确了其合成化学途径(汤迎湛等,2014)。我国的科学家从羊蹄甲中分离了至少10个黄酮化合物,并研究了这些化合物在抑制血小板聚集活性和抗糖尿病中的作用(尚小雅等,2006；汤迎湛等,2014)。

开发植物源抑菌活性物质是新农药创制的一个重要途径。目前对羊蹄甲的研究主要集中于叶、花的微量元素和化学成分研究,对种子中的成分研究相对缺失。由于我国南方羊蹄甲资源丰富,为了对羊蹄甲进行多方面开发,我们选取易得的红花羊蹄甲种子为实验材料,从中提取粗提物,研究其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、番茄青枯菌、柑橘溃疡病菌和烟草野火细菌的抑菌活性；进一步利用超滤离心管分离粗提物中的蛋白,分析蛋白组分是否有抑菌活性,为何种蛋白,以期从蛋白合成途径人工合成此类抑菌活性蛋白,应用于农业生产。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 羊蹄甲种子为网购的红花羊蹄甲种子。

1.1.2 菌株 大肠杆菌(Escherichia coli)、番茄青枯菌(Ralstonia solanacearum)、柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri)和烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tobaci)来自福建农林大学植物病原细菌实验室,金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来自福建农林大学教育部生物农药与化学生物学重点实验室。

1.1.3 主要仪器 超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司),低温离心机(Eppendorf公司),超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司),电热恒温培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性物质的提取 取饱满、无病变的红花羊蹄甲种子,用九阳豆浆机粉碎,准确称取2 g粉末,加入60 mL PBS缓冲液(pH 7.0)(唐根源等,2000),置于冰浴中用超声波细胞粉碎机破碎4 min(破碎7 s,间歇4 s)(王雪等,2011)。破碎后的样品在4℃条件下12 000 rpm离心2 min,取上清液过一次性过滤灭菌器(0.2 μm),滤液(即粗提物)保存于－20℃,用于抑菌活性分析和蛋白分离。

1.2.2 粗提物的平板抑菌检测 将新鲜活化的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、番茄青枯菌(Ralstonia solanacearum)、柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri)和烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tobaci)分别接种到3 mL牛肉浸膏液体培养基中过夜培养,再按1∶100接种量转接到新鲜的4 mL牛肉浸膏液体培养基,待培养液OD600约为2.0时,将培养液的OD600调整到1.0。在融化的固体培养基冷却至40－50℃时,按每25 mL固体培养基加1 mL菌液(OD600＝1.0)的配比加入菌液,迅速摇匀倒入干净的培养皿(徐玲等,2006),冷却后即成含菌平板。在含菌平板上放置直径为6 mm的灭菌滤纸,滴加－20℃保存的红花羊蹄甲种子粗提物40 μL检测,正置培养24 h后,观察并测量抑菌圈大小(潘俊等,2011)。以上操作均在超净台中完成。

1.2.3 粗提物中蛋白成分的分离 取－20℃保存的红花羊蹄甲种子粗提物500 μL,加至超滤离心管(Prodipta,2012)(Microsep Advance Centrifugal Devices Incorporate 10K Omega Membrane),该离心管分为浓缩柱、收集管两部分。在4℃条件下,12 000 rpm离心15 min,保留收集管中的废液。加入等体积PBS缓冲液漂洗浓缩柱膜上的蛋白浓缩样品,再次离心,保留收集管中的漂洗液,与废液合并,用于蛋白组分分析。重复漂洗浓缩柱2－3次,最后用等体积PBS缓冲液悬浮浓缩柱的蛋白样品,即得到分离的蛋白成分,保存于－20℃,用于SDS-PAGE电泳实验和抑菌活性分析。

1.2.4 粗提物、蛋白成分、漂洗废液的SDS-PAGE电泳试验 为明确粗提物、蛋白分离液和漂洗废液中蛋白组分的差异,以便结合后续蛋白分离液和漂洗废液的平板抑菌试验结果来分析红花羊蹄甲种子活性提取物抑菌成分是否为蛋白成分,分别取20 μL粗提物、蛋白分离液和漂洗废液,加入5×SDS上样缓冲液,100℃煮沸5 min后,采用5%浓缩胶及15%分离胶进行不连续垂直平板电泳。电泳时电压先设定在80 V,待样品进入分离胶后再调至120 V。电泳完毕后,将凝胶剥离后放入染色液中振荡染色3 h,然后用蒸馏水漂洗后加入脱色液,在摇床上振荡脱色,直至蛋白质条带清晰为止(梁梓强等,2015)。

1.2.5 粗提物中蛋白成分的平板抑菌检测 参照1.2.2方法分别制成本文6种含菌平板。在含菌平板上放置直径为6 mm的灭菌滤纸,滴加－20℃保存的蛋白分离液40 μL检测,正置培养24 h后,观察并测量抑菌圈大小(潘俊等,2011)。以上操作均在超净台中完成。

1.2.6 粗提物的漂洗废液的平板抑菌检测 参照1.2.2方法分别制成本文6种含菌平板。在含菌平板上放置直径为6 mm的灭菌滤纸,滴加－20℃保存的漂洗废液40 μL检测,正置培养24 h后,观察并测量抑菌圈大小(潘俊等,2011)。以上操作均在超净台中完成。

2 结果与分析

2.1 粗提物的平板抑菌检测

按2 g种子粉末加PBS缓冲液60 mL的比例,通过超声波获得的粗提物,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、番茄青枯菌、柑橘溃疡病菌和烟草野火病菌都有抑菌活性。结果显示:粗提物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最高,抑菌圈的大小可达到2.1 cm,对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、番茄青枯菌、柑橘溃疡病菌和烟草野火病菌的抑菌活性稍低,抑菌圈大小分别是1.5、1.6、1.6、1.7 和 1.8 cm(图 1)。

图1 粗提物平板抑菌检测Figure 1 The inhibitory effect of crude extract from B.blakeana seeds on six microbes

2.2 粗提物、蛋白成分、漂洗废液的SDS-PAGE电泳试验

为了考察粗提物、蛋白分离液和漂洗废液中的蛋白组分是否有区别,我们对粗提物、蛋白分离液和漂洗废液进行SDS-PAGE电泳。结果显示:粗提物和蛋白分离液样品中都约有25条主要的蛋白带,其中在45 kDa和16 kDa位置的2个蛋白条带的量最大。从电泳的蛋白条带来看,蛋白分离液中的蛋白组分与粗提物相比,蛋白条带数都保持一致,表明浓缩后的蛋白组分没有发生明显变化,且浓度更高。在漂洗废液的泳道中,没有观察到蛋白条带的出现,漂洗废液中不含有蛋白组分(图2)。

2.3 粗提物中蛋白成分的平板抑菌检测

将粗提物经超滤离心管离心后,取40 μL蛋白分离液滴加到含菌平板,观察对病原细菌的抑菌作用。结果显示,所获得的蛋白分离液,对6种测试细菌都没有抑菌作用(图3)。

2.4 提物的漂洗废液的平板抑菌检测

将粗提物经超滤离心管离心后,取40 μL漂洗废液滴加到含菌平板,观察对病原细菌的抑菌作用。结果显示,所获得的漂洗废液仍然保留着对细菌的抑菌活性,但抑菌圈较粗提物的抑菌圈小,推测应该是分离出来的废液和PBS漂洗液混合后,有效成分相对于粗提物来说,浓度更小(图4)。

结合2.2 SDS-PAGE电泳试验结果,蛋白组分与粗提物一致且浓度更高,而漂洗废液中没有蛋白组分。综上所述推测,用PBS缓冲液提取的红花羊蹄甲种子粗提物,经超滤离心管离心过滤后,蛋白分离液中的蛋白组分对供试6种菌株没有抑菌活性,抑菌活性物质存在于漂洗废液中,粗提物中对6种供试菌株起到抑菌作用的物质应该不是其中的蛋白组分,至于漂洗废液中起到抑菌作用的成分有待继续试验分析。

图2 红花羊蹄甲种子提取物的SDS-PAGE电泳分析Figure 2 SDS-PAGE analysis of extract from B.purpurea seeds

图3 粗提物中蛋白成分的平板抑菌检测Figure 3 The inhibitory effect of extract proteins from B.blakeana seeds on six microbes

图4 粗提物的漂洗废液的平板抑菌检测Figure 4 The inhibitory effect of extract wash buffer from B.blakeana seeds on six microbes

3 讨论

红花羊蹄甲植物种子与叶片、茎枝一样,含有抑菌活性物质。羊蹄甲是豆科羊蹄甲属植物,含有多个植物品种。前期研究从显脉、红绒和大叶羊蹄甲茎枝和叶片中分离到抑菌活性物质,利用甲醇、乙醇、己烷、丙酮和二氯甲烷等为溶剂,均可超声萃取活性物质(Boonphong et al.,2007；Negi et al.,2012)。Fang等人(2012)从羊蹄甲种子分离出一个20 kDa大小的胰蛋白酶抑制物,可以诱导肿瘤细胞坏死,显示在肝癌防治中的应用前景。本文用PBS缓冲液作为萃取载体,从红花羊蹄甲的种子中分离出对几种微生物有抑菌活性的粗提物,表明羊蹄甲的种子组织中也含有抑菌的活性成分。

羊蹄甲种子植物的抑菌物质可用于植物病原细菌的防控。前期的研究结果表明:羊蹄甲的树皮、根、叶可作为药用,具有补肾气,提神,止血,镇咳等功效,所获得提取物对真菌也有生物学抑菌活性,但对植物病原菌的作用效果还不明确。我们以羊蹄甲种子为实验材料获得超声提取物,并检测对6种微生物的抑制作用。在平板对峙实验中,粗提物不仅对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的生长有抑制作用,而且对番茄青枯菌、柑橘溃疡病菌和烟草野火病菌3种植物病原细菌也有显著的抑菌活性。

报道羊蹄甲中的活性物质以黄酮类化合物为主的文献已经很多,也有文献报道利用色谱分析出的有效成分达十几种之多,研究比较成熟,本文不再赘述。本文研究发现种子粗提物对植物病原细菌有抑菌活性以后,利用蛋白浓缩柱对粗提物中的蛋白组分进行分离,发现蛋白组分对病原菌没有抑菌活性,而经超滤离心管过滤的漂洗废液仍然保留了抑菌活性,说明抑菌活性物质不是蛋白,故猜测对植物病原细菌有抑菌活性的主要有效成分可能还是黄酮类化合物。后续研究可对漂洗废液是否含有黄酮类化合物以及是否起抑菌作用进行分析,并明确其对病原菌的抑菌机理。

梁梓强,梁士可,张梅,等,2015.褐飞虱可溶性蛋白SDS-PAGE电泳分析[J].中山大学学报(自然科学版),54(6):27-30.

潘俊,石瑶,徐明,等,2011.植物提取物对大豆疫霉菌抗菌活性的初步研究[J].天然产物研究与开发,23:212-218.

尚小雅,李帅,王映红,等,2006.红绒毛羊蹄甲的化学成分研究[J].中国中药杂志,31(23):1 953-1 955.

汤迎湛,邢亚超,门瑞芝,等,2014.显脉羊蹄甲的生物活性成分[J].沈阳药科大学学报,31(3):188-240.

唐根源,张椿嵋,吴红京,2000.植物草乌毒蛋白的分离及性质[J].分析测试学报,19(3):40-42.

王雪,权春善,王建华,等,2011.不同细胞破碎方法对无细胞蛋白表达系统细胞抽提物活性的影响[J].中国生物工程杂志,31(1):46-50.

徐玲,王伟,魏鸿刚,等,2006.多粘类芽孢杆菌HY96-2对番茄青枯病的防治作用[J].中国生物防治,22(3):216-220.

Boonphong S,Puangsombat P,Baramee A,et al,2007.Bioactive compounds from Bauhinia purpurea possessing antimalarial,antimycobacterial,antifungal,anti-inflammatory,and cytotoxic activities[J].Journal of Natural Products,70:795-801.

Fang E F,Bah C S,Wong J H,et al,2012.A potential human hepatocellular carcinoma inhibitor from Bauhinia purpurea L.seeds:from purification to mechanism exploration[J].Archives of Toxicology,86:293-304.

Negi B S,Dave B P,Agarwal Y K,2012.Evaluation of antimicrobial activity of Bauhinia purpurea leaves under in vitro conditions[J].Indian Journal of Microbiology,52(3):360-365.

Prodipta S,Shinji Y,Soumen B,et al,2012.Purification and characterization of a new alkali-thermostable lipase from Staphylococcus aureus isolated from Arachis hypogaea rhizosphere[J].Process Biochemistry,47:838-866.

Study on extraction and antimicrobial constituents from Bauhinia blakeana seeds

HU Xun,YUAN Su-Su,YE Xiu-Juan,ZOU Hua-Song∗
(College of Plant Protection,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002,China)

For validating the antimicrobial activity of extraction from Bauhinia blakeana seeds,the paper chose ultrasonic to crush the seeds,and centrifuge tube to separate the proteins from extracts.The results of plate inhibitory experiments showed that the extracts had inhibitory effects on Staphylococcus aureus,Escherichia coli,Bacillus subtilis,Ralstonia solanacearum,Xanthomonas citri subsp.citri and Pseudomonas syringae pv.tobaci.The results of SDSPAGE showed that antimicrobial substances in the extracts were not protein components.

Bauhinia blakeana； antimicrobial activity； extract； plant pathogenic bacteria

S432.1

A

1001－4276－(2017)01－0101－05

户 勋，袁素素，叶秀娟，等，2017.红花羊蹄甲种子活性物质提取及其抑菌作用研究[J].武夷科学，33:101-105.

2017－07－08。

福建省科技厅引导项目(2016N0006)；福建农林大学青年教师科研基金项目(2013xjj07)。

户勋(1982－)，女，硕士研究生。研究方向:生物大分子。Email:215226648＠qq.com。∗

邹华松(1972－)，男，教授。研究方向:微生物－植物相互作用的分子遗传学。Email:hszou＠fafu.edu.cn。

(责任编辑:陈晓雯)