葡萄籽总酚的提取及其抗氧化活性评价*

咸玥桐,高 原,王 越,赵莹莹,王 曦,李 凡，张晓萌

（哈尔滨商业大学 药学院 细胞与分子生物学研究所，黑龙江 哈尔滨150076）

葡萄籽总酚的提取及其抗氧化活性评价*

咸玥桐,高 原,王 越,赵莹莹,王 曦,李 凡，张晓萌

（哈尔滨商业大学 药学院 细胞与分子生物学研究所，黑龙江 哈尔滨150076）

本文通过比较几种不同提取方法对葡萄籽总酚进行了提取，进一步对葡萄籽总酚的含量进行了测定，并通过DPPH自由基清除率的测定、FRAP总抗氧化能力评价了几种提取方法葡萄籽总酚的抗氧化能力。实验结果表明，超声波辅助提取法葡萄籽总酚提取物提取率最高，达到52.68%，总酚含量为57.40mg GAE·g-1。抗氧化实验表明超声波辅助提取法葡萄籽总酚的DPPH清除率较高，IC50值为0.13倍葡萄籽总酚提取液，FRAP总抗氧化能力在总酚原液条件下达到175.84μm FeSO4。本研究为葡萄籽资源的开发和综合利用提供了基础。

葡萄籽，总酚；DPPH；FRAP；抗氧化

葡萄籽是葡萄加工产业中的副产物之一，它不仅营养丰富，还有很高的保健价值。国内外研究发现，葡萄籽的功效主要包括：清除自由基、抗衰老、增强自身免疫力、美容护肤、抗过敏、保护心血管、防辐射、保护消化系统等功能。综合高效的利用葡萄籽，可变废为宝，保护环境，节约资源，又能创造良好的经济与社会效益[1-3]。

本文通过比较几种不同提取方法对葡萄籽总酚进行了提取，进一步对葡萄籽总酚的含量进行了测定，并通过DPPH自由基清除率的测定、FRAP总抗氧化能力评价了几种提取方法葡萄籽总酚的抗氧化能力。为葡萄籽多酚类物质在食品、医药、美容等多方面的应用奠定了基础。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

葡萄籽（购自哈尔滨家乐福超市）；福林-酚试剂（上海源叶生物科技公司）；没食子酸对照品（中国药品生物制品检定所）；TPTZ（上海新宝精细化工厂）；DPPH（Sigma）；FeCl3（上海新宝精细化工厂）；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BSA223S-CW分析天平（上海精天电子仪器公司）；FW-100高速万能粉碎机，（北京永光明医疗仪器有限公司）；KQ3200DV数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；HH-ZK二孔多能水浴锅（郑州英峪予乎华仪器有限公司）；SHB-III循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；T6新世纪型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。

1.3 实验内容与方法

1.3.1 葡萄籽中总酚的提取方法考察 将葡萄籽经过粉碎机粉碎，过80目筛之后，准确称取粉碎后的葡萄籽样品。用适量的石油醚浸泡30min，过滤后，将滤渣摊开以利于石油醚的挥发。分别通过乙醇浸提法、热回流提取、超声波辅助提取、微波辅助提取等方法对葡萄籽中的总酚进行提取。提取完毕后料液经抽滤后，将滤液用旋转蒸发仪浓缩，得葡萄籽粗提物。将粗提物用乙醇溶解，备用[4,5]。每种方法均取10g葡萄籽粉末于三角瓶中，料液比为1∶20、浸提时间2h、超声功率150W、温度50℃、超声及微波时间30min。

1.3.2 葡萄籽提取物总酚含量的测定 标准曲线的制备：精密称取没食子酸对照品50mg，放置在100mL容量瓶中，加适量蒸馏水，超声溶解，放冷，定容。分别配制浓度为50,100,150,200,250,300,350,400,450,500mg·L-1的没食子酸标准品，分别取各标准溶液40μL置于离心管中，加入10倍稀释的福林-酚试剂1.8mL，室温放置5min，加入1.2mL 7.5%的碳酸钠溶液，作用90min，765nm检测OD值。建立标准曲线。

取样品溶液40μL置于离心管中，加入10倍稀释的福林-酚试剂1.8mL，室温放置5min，加入1.2mL 7.5%的碳酸钠溶液，作用90min，765nm测OD值检测。总酚含量表示为mg（GAE）·g-1[6,7]。

1.3.3 葡萄籽总酚 DPPH自由基清除率的测定分别将4种不同提取方法获得的葡萄籽总酚提取物浸膏定容至10mL乙醇溶解，并对样品溶液进行二倍稀释，分别取不同稀释倍数的各样品溶液（1.00，0.50，0.25，0.13，0.063,0.031）100μL，置 4mL离心管中，加入1.4mL无水乙醇，1.0mL的DPPH溶液，室温避光反应70min，同时用无水乙醇做空白，在517nm波长处测定吸光值；以1.5mL无水乙醇加1mL DPPH为对照。按下列公式计算DPPH自由基清除率。用无水乙醇做空白对照[8,9]。见式（1）

式中 Ac：1.5mL无水乙醇 +1mLDPPH；A0：100μL样品+1.4mL无水乙醇+1mL DPPH。

1.3.4 葡萄籽总酚FRAP总抗氧化能力实验 依次配 制 1000、800、600、400、200、100μmol·L-1FeSO4标准溶液，取0.3mL FeSO4与2.7mL FRAP工作液充分混合，37℃保温30min，于593nm下测定吸光度，绘制标准曲线，得到回归分方程式：y=0.0023x+0.191（R2=0.9996）。以 1μmol·L-1FeSO4为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO4的微摩尔数表示。

分别取不同稀释倍数的各葡萄籽总酚溶液（1.00，0.50，0.25，0.13，0.063,0.031）300μL 与 2.7m LFRAP工作液混合，在37℃恒温水浴锅中保温30min，593nm测吸光度。将300μL无水乙醇和2.7mL FRAP工作液混合液作对照。空白是无水乙醇。根据获得的标准曲线得方程，以1μmol·L-1FeSO4为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO4微摩尔数表示[10]。

1.3.5 统计学处理及方法。 应用SPSS统计软件包进行数据统计学处理。采用ANOVA方差分析并行方差齐性检验；结果以X±S表示

2 结果与讨论

2.1 葡萄籽中总酚的提取方法考察

对乙醇浸提法、热回流提取、超声波辅助提取、微波辅助提取等方法对葡萄籽中的总酚进行提取，提取率计算公式如下：

式中 m：葡萄籽粗粉质量，g；n：滤液中浸膏的质量，mg。

比较几种提取葡萄籽总酚的方法，超声辅助提取的方法葡萄籽中总酚的提取率较高，提取效果较好，达到52.68%，见图1。

2.2 葡萄籽总酚的含量测定

以765nm吸光度为纵坐标、没食子酸浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线的线性回归方程为：y=0.0022x+0.0729（R2=0.9991），结果表明，在50～500mg·L-1范围内没食子酸对照品的浓度与吸光度成良好的线性关系。根据回归方程，对四种提取方法的总酚含量进行测定，总酚含量表示为mg（GAE）·g-1，见式（3）

经计算可知，超声波辅助提取葡萄籽中总酚含量最高，代入数据得到葡萄籽提取物中总酚含量为57.40mg·g-1，见图 1。

图1 不同提取方法葡萄籽多酚提取率及含量比较Fig.1 Grape seed polyphenols extraction yield and content by different methods

2.3 DPPH自由基清除率的测定结果

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基是一种稳定的有机自由基，常用来评价抗氧化物质的体外抗氧化能力。其能力用清除率来表示，清除率越大，其抗氧化能力越强[10]。4种不同提取方法所获得的葡萄籽总酚提取液的IC50值分别为0.19、0.16、0.13和0.15倍原液浓度，即当乙醇浸提法、热回流提取、超声波辅助提取、微波辅助提取获得的总酚溶液分别稀释至 0.19、0.16、0.13和 0.15倍时，DPPH 清除率达到50%（见图2）。葡萄籽总酚提取物具有较好的清除自由基能力，且超声波辅助提取法葡萄籽总酚溶液的清除自由基能力最强。阳性对照维生素C的DPPH清除自由基实验其IC50值为0.756μg·mL-1。

图2 DPPH清除自由基实验Fig.2 DPPH radical scavenging assay

由图2可以看出，几种提取方法下的葡萄籽多酚稀释液对DPPH自由基的清除作用随着浓度的增加而增强，表明葡萄籽多酚清除自由基的能力越强，抗氧化的能力也越强。

2.4 FRAP总抗氧化能力实验

在FRAP铁还原能力实验中，抗氧化剂通过自身的还原作用给出电子而清除自由基。样品中的抗氧化剂可使铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]）的 Fe3+被还原成Fe2+，与 FeCl3生成普鲁士兰（Fe4[Fe（CN）6]3），在700nm处有最大吸光度，因此，可通过测定还原力来说明其清除自由基能力的大小，还原力越强，抗氧化能力越强。

通过绘制硫酸亚铁标准曲线，得到回归分方程式：y=0.0023x+0.191（R2=0.9996）。根据获得的标准曲线得方程，以1μmol·L-1FeSO4为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO4微摩尔数表示。把数据带入回归方程，计算得出4种不同提取方法，即乙醇浸提法、热回流提取、超声波辅助提取、微波辅助提取获得的葡萄籽总酚提取液的FRAP值，分别为 136.29、145.32、175.84 和 157.48μm

FeSO4，阳性对照生育酚 （Trolox） 的 IC50值为0.96μg·mL-1。

实验结果表明，超声波辅助提取法获得的葡萄籽总酚提取液的FRAP值较大，具有较好的抗氧化能力，且随着样品浓度的增加，FRAP值也随之增加，表明浓度越高抗氧化能力越强（见图3）。

图3 总抗氧化能力实验Fig.3 Ferric ion total antioxidant power assay

3 结论

本文通过乙醇浸提法、热回流提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法比较几种不同提取方法对葡萄籽总酚的溶出及抗氧化能力。进一步对不同提取方法下葡萄籽提取液的总酚含量进行了测定，并通过DPPH自由基清除率的测定、FRAP总抗氧化能力评价了几种提取方法葡萄籽总酚的抗氧化能力。实验结果表明，超声波辅助提取法葡萄籽总酚提取物提取率最高，达到52.68%，总酚含量为57.40mg GAE·g-1。抗氧化实验表明超声波辅助提取法葡萄籽总酚的DPPH清除率较高，IC50值为0.13倍葡萄籽原液浓度，FRAP总抗氧化能力在总酚原液条件下达到 175.84μm FeSO4。

超声波辅助提取法作为一种常用的有效提取方式，能够利用超声波的机械破碎和空化效应，加速有效成分的扩散和溶解，时间短、效率高，较其他提取方法有着明显的优势。该方法在葡萄籽多酚的提取以及葡萄籽资源的综合开发和利用有着广阔的前景，本研究也为葡萄籽多酚类成分抗氧化活性及机制的研究奠定了基础。

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Total phenolic extract of grape seed and antioxidant activity evaluation*

XIAN Yue-tong,GAO Yuan,WANG Yue,ZHAO Ying-ying,WANG Xi,LI Fan,ZHANG Xiao-meng
（College of Pharmacy,Cell and Molecular Biology Research Institute,Harbin Commercial Vniversity,Harbin 150076，China）

In this paper,the total phenol extract of grape seed were extracted by different methods,and the total phenol content was determined.The antioxidant capacity of grape seed total phenol extract was evaluated by DPPH free radical scavenging and FRAP total antioxidant capacity tests.The results showed that ultrasonic assisted extraction method has the highest yield reached 52.68%,the total phenol content was 57.40 GAE mg·g-1.Antioxidant tests showed that ultrasonic assisted extraction of grape seed total phenol DPPH scavenging rate is highest,the IC50value was 0.13 times concentration of grape seed total phenol extract.FRAP total antioxidant capacity value was 175.84μm FeSO4.This study provides the basis on the development and comprehensive utilization of grape seed resources.

grape seed;total phenols；DPPH；FRAP；antioxidant activity

TS262

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20171167

2017-09-26

哈尔滨市科技局青年后备人才项目（2016RQQXJ115）；哈尔滨商业大学大学生创新创业训练计划国家级项目（201610240004）资助

高 原（1983-），女，讲师，博士，主要从事药用植物、微生物次生代谢产物活性研究。