野生型PTEN过表达对体外活化肝星状细胞内钙离子浓度的影*

郝礼森，宋小杰，王玉兰，刘玉龄，宋洁，张明婷，靳丽敏，张朋垒

（华北理工大学附属医院 消化内科，河北 唐山 063000）

野生型PTEN过表达对体外活化肝星状细胞内钙离子浓度的影*

郝礼森，宋小杰，王玉兰，刘玉龄，宋洁，张明婷，靳丽敏，张朋垒

（华北理工大学附属医院 消化内科，河北 唐山 063000）

目的探讨野生型第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因（PTEN）过表达对体外活化肝星状细胞（HSC）内钙离子浓度的影响。方法体外培养活化大鼠肝星状细胞系（HSC-T6），利用腺病毒载体，将野生型PTEN基因转染活化HSC；Western blot及实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测HSC的PTEN蛋白及mRNA表达；采用钙离子荧光探针Rhod-2/AM，于激光扫描共聚焦显微镜下检测HSC内钙离子浓度变化。实验分组：①Control组：腺病毒转染时以DMEM代替病毒液；②Ad-GFP组：转染表达绿色荧光蛋白（GFP）的对照空病毒Ad-GFP；③Ad-PTEN组：转染携带野生型PTEN基因并表达GFP的重组腺病毒Ad-PTEN。结果野生型PTEN在活化大鼠HSC大量表达，3组HSC内钙离子浓度比较，差异有统计学意义（P＜0.05），Ad-PTEN组HSC内钙离子浓度（251.60±90.88）低于Control组（1 953.95±132.99）及Ad-GFP组（1 937.57±115.17），而Control组与Ad-GFP组之间HSC内钙离子浓度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论野生型PTEN过表达可降低体外活化大鼠HSC内钙离子浓度。

肝星状细胞；第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因；细胞内钙离子浓度

钙离子（Ca2+）作为细胞内第2信使，在细胞兴奋、增殖、收缩等一系列细胞生物学功能中发挥重要作用[1]。第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，它的异常表达与人类多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。近年来对PTEN的研究已从肿瘤领域逐渐延伸到非肿瘤领域。研究发现[2]，PTEN过表达可通过下调大鼠心肌细胞内钙离子浓度阻滞来血管紧张素Ⅱ引起的心肌细胞肥大。而在PTEN与肝纤维化的相关研究中发现[3]，过表达的野生型PTEN可抑制体外活化肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）的增殖。但PTEN过表达对HSC内Ca2+浓度的影响仍不清楚。为此，本研究利用腺病毒载体，将野生型PTEN基因转染体外活化HSC，构建体外HSC的PTEN过表达模型，探讨PTEN过表达对活化HSC内Ca2+浓度的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂

表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的空病毒Ad-GFP、携带野生型PTEN基因并表达GFP的腺病毒Ad-PTEN均由第三军医大学祝善俊教授惠赠，通过反复感染293A细胞的方法扩增腺病毒，并测定其滴度。胎牛血清购于以色列BI公司，DMEM培养基及HBSS购于美国Gibco公司，钙离子荧光探针Rhod-2/AM购于美国Invitrogen公司，活化大鼠肝星状细胞系（HSC-T6）购自中国医学科学院肿瘤医院，小鼠抗PTEN单克隆抗体购于英国Abcam公司，兔抗3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体购于美国Affinity公司，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG购于美国KRL公司。

1.2 腺病毒转染活化HSC

腺病毒转染前细胞培养24 h，吸去培养基，用DMEM洗涤2次；按感染倍数100确定转染所需病毒量（病毒量=细胞数×感染倍数），用少量DMEM稀释病毒液（能覆盖细胞表面即可）；轻轻倾斜并晃动培养皿，以保持病毒液均匀，于37℃、5%二氧化碳培养箱内孵育2 h，每隔15 min晃动培养皿1次，以促进感染；补充培养基，继续培养至所需时间，倒置荧光显微镜下观察GFP表达，测得表达绿色荧光的细胞数占总细胞数的比例（转染效率）在80%以上。实验分组：①Control组，腺病毒转染时以DMEM代替病毒液；②Ad-GFP组，转染表达GFP的对照空病毒Ad-GFP；③Ad-PTEN组，转染携带野生型PTEN基因并表达GFP的重组腺病毒Ad-PTEN。

1.3 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测HSC中PTEN mRNA表达

按上述分组要求处理HSC后48 h，收集各组HSC，按照Trizol试剂盒说明书提供的方法提取总RNA，逆转录合成cDNA；目的基因PTEN及内参照基因GAPDH引物由上海英俊生物技术有限公司合成。引物序列：PTEN正向引物5'-TCCTGCAGA AAGACTTGAAGGT-3'，反向引物5'-GCTGTGGTGGG TTATGGTCT-3'，扩增产物大小为182 bp；GAPDH正向引物5'-GGCTCATGACCACAGTCCAT-3'，反向引物5'-ACATTGGGGGTAGGAACACG-3'，扩增产物大小为202 bp。在Master cycler ep Real Plex4 qRT-PCR仪上进行扩增。各反应体系扩增后，PCR仪显示S形扩增曲线平滑完整，上升迅速陡峭并很快到达平台期，熔解曲线单峰，提示扩增产物单一，无非特异性扩增。采用相对定量2-△△Ct法比较各组HSC的PTEN mRNA表达[4]。

1.4 Western blot检测HSC中PTEN蛋白表达

按上述分组要求处理HSC后48 h，收集各组细胞并提取蛋白，BCA法测定蛋白含量。一抗小鼠抗PTEN多克隆抗体以1∶100稀释、兔抗GAPDH单克隆抗体以1∶1 000稀释，二抗HRP标记的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG均以1∶5 000稀释，采用Image JV1.47H软件对图像结果进行定量分析，图像灰度值以积分光密度（IOD）值表示，结果以目的蛋白与GAPDH的IOD比值表示。

1.5 Ca2+荧光探针Rhod-2/AM检测HSC内Ca2+浓度

将HSC以4×104个接种于激光扫描共聚焦显微镜专用皿中，生长24 h后，按照上述分组处理细胞，继续培养48 h，以HBSS溶液冲洗细胞3次；加入配制的浓度为5μmol/L的Rhod-2/AM工作液，充分覆盖培养皿中的细胞，置于37℃、5% CO2细胞培养箱避光孵育30 min，除去Rhod-2/AM工作液，置于激光扫描共聚焦显微镜下，用557 和581 nm波长的激发光激发Ca2+荧光探针Rhod-2/AM发射荧光，随机选取6个视野进行观察，利用激光扫描共聚焦显微镜的图像量化分析系统进行图像分析，得出HSC平均Ca2+荧光强度。由于细胞的荧光强度与细胞内游离Ca2+浓度呈正比，因此本实验中用荧光强度表示细胞内游离Ca2+浓度[5]。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 野生型PTEN基因在活化HSC大量表达

腺病毒感染HSC 48 h，qRT-PCR检测HSC的PTEN mRNA表达，Ad-GFP组、Ad-PTEN组HSC的PTEN mRNA表达量相对于Control组（Control组HSC的PTEN mRNA表达量确定为1）分别为1.03和1.90倍，3组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），Ad-PTEN组HSC的PTEN mRNA表达高于Control组及Ad-GFP组，而Control组与Ad-GFP组之间差异无统计学意义（P＞0.05）（见表1）。进一步用Western blot检测显示，3组HSC的 PTEN蛋白表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），Ad-PTEN组HSC的PTEN蛋白表达较Control组及Ad-GFP组升高，Control组与Ad-GFP组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图1。

2.2 过表达的野生型PTEN降低HSC内Ca2+浓度

各组HSC内Ca2+浓度检测显示，3组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），Ad-PTEN组较Control组及Ad-GFP组降低，而Control组与Ad-GFP组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2、图2。

表1 3组活化HSC的PTEN mRNA及蛋白表达水平比较 （n =6，±s）

表1 3组活化HSC的PTEN mRNA及蛋白表达水平比较 （n =6，±s）

注：△△Ct=腺病毒转染组△Ct（Ct PTEN-CtGAPDH）-Control组△Ct（Ct PTEN-Ct GAPDH）；†与Control组及Ad-GFP组比较，P ＜0.05

PTEN mRNA ΔCt（±s）ΔΔC t2-ΔΔCt Control组 7.04±0.04 0.00 1.00 0.56±0.05 Ad-GFP 组 6.99±0.04 -0.05 1.03 0.69±0.07 Ad-PTEN组 6.11±0.07 -0.93 1.90† 1.08±0.07†组别PTEN蛋白（±s）

图1 腺病毒感染HSC 48 h各组HSC的PTEN蛋白表达

表2 腺病毒感染HSC 48 h各组HSC内Ca2+的平均荧光强度 （n =6，±s）

表2 腺病毒感染HSC 48 h各组HSC内Ca2+的平均荧光强度 （n =6，±s）

注：†与Control组及Ad-GFP组比较，P ＜0.05

组别 Ca2+荧光强度Control组 1 953.95±132.99 Ad-GFP组 1 937.57±115.17 Ad-PTEN 组 251.60±90.88†

图2 腺病毒感染HSC 48 h各组HSC内Ca2+荧光强度 （激光扫描共聚焦显微镜×100）

3 讨论

肝纤维化是各种慢性肝病演变为肝硬化的病理过程，而HSC则是参与此过程的主要细胞。HSC的活化、增殖，以及在肝脏损伤部位黏附、迁移，并进一步合成大量细胞外间质是肝纤维化形成的中心环节[6-7]。Ca2+作为重要的细胞内第2信使，在细胞兴奋、增殖、收缩等一系列细胞生物学功能中发挥重要作用[1]，而细胞收缩又与细胞黏附、迁移相关。并且，已有研究显示[8]大鼠HSC内钙离子增加可引起HSC收缩。因此HSC内Ca2+浓度变化与HSC黏附迁移等生物学行为有关。

PTEN蛋白是一个具有脂质磷酸酶活性及蛋白磷酸酶活性的双重特异性磷酸酶。近年来的研究发现，PTEN不仅与某些肿瘤的发生发展密切相关，也参与了一些非肿瘤性疾病的病理过程。研究显示[9]，胆总管结扎大鼠纤维化肝组织及在体外HSC的PTEN表达下降，但PTEN对活化HSC内Ca2+浓度的影响仍不清楚。为此，本实验将腺病毒介导的野生型PTEN基因转染体外活化HSC，在证实野生型PTEN基因成功转染HSC并上调PTEN表达后，应用Ca2+荧光探针Rhod-2/AM及激光扫描共聚焦显微镜技术，观察了HSC内Ca2+浓度的变化。结果表明，野生型PTEN过表达可降低活化HSC内Ca2+浓度。这与上述研究结果相一致，提示PTEN过表达不仅可下调心肌细胞内Ca2+浓度，也下调活化HSC内Ca2+浓度，HSC内Ca2+浓度的降低可能参与了PTEN过表达对活化HSC增殖的抑制。至于PTEN过表达是否能通过降低活化HSC内Ca2+浓度，进而抑制活化HSC黏附、迁移，尚待进一步研究。

[1]刘刚, 胡蕴玉, 赵建宁, 等. Ⅰ型胶原促进骨髓基质干细胞粘附的细胞机制[J]. 中华创伤骨科杂志, 2006, 8(6)： 549-552.

[2]YU L J, ZHU S J, ZHOU Y Z, et al. Angiotensin II induced cardiac hypertrophy is blocked by PTEN via suppressing Ca2+/Calcineurin pathway[J]. Chinese Journal of Cardiology, 2006, 34(6)： 541-545.

[3]郝礼森, 张晓岚, 安君艳, 等. PTEN过表达及其突变对体外活化肝星状细胞凋亡的影响[J]. 中华消化杂志, 2009, 29(8)： 529-533.

[4]AROCHO A, CHEN B, LADANYI M, et al. Validation of the 2-DeltaDeltaCt calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts[J]. Diagn Mol Pathol, 2006, 15(1)： 56-61.

[5]薛秀兰, 林菊生. 靶向瘦素基因小干扰RNA抑制肝星状细胞增殖和细胞内Ca2+浓度[J]. 华中科技大学学报(医学版), 2014,43(6)： 631-635.

[6]LEE U E, FRIEDMAN S L. Mechanisms of hepatic fibrogenesis[J].Best Pract ResClin Gastroenterol, 2011, 25(2)： 195-206.

[7]PUCHE J E, SAIMAN Y, FRIEDMAN S L. Hepatic stellate cells and liver fibrosis[J]. Compr Physiol, 2013, 3(4)： 1473-1492.

[8]LALEMAN W, VAN LANDEGHEM L, SEVERI T, et al. Both Ca2+-dependent and -independent pathways are involved in rat hepatic stellate cell contraction and intrahepatic hyperresponsiveness to methoxamine[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2007,292(2)： 556-564.

[9]HAO L S, ZHANG X L, AN J Y, et al. PTEN expression is downregulated in liver tissues of rats with hepatic fibrosis induced by biliary stenosis[J]. APMIS, 2009, 117(9)： 681-691.

（张蕾 编辑）

Effect of wild-type PTEN over-expression on intracellular calcium ion concentration in activated hepatic stellate cells in vitro*

Li-sen Hao, Xiao-jie Song, Yu-lan Wang, Yu-ling Liu, Jie Song, Ming-ting Zhang,Li-min Jin, Peng-lei Zhang
(Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology, Tangshan, Hebei 063000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of over-expression of wild-type phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten (PTEN) on the intracellular calcium ion concentration in activated hepatic stellate cells (HSCs)in vitro.MethodsUsing adenoviral vector, wild-typePTENgene was transduced into activated rat HSC (HSC-T6)in vitro, and the expressions ofPTENmRNA and protein were detected by qRT-PCR and Western blot. Then with the help of laser scanning confocal microscope (LSCM), the changes of intracellular calcium ion concentration in HSCs were detected using calcium ion fluorescence probe Rhod-2/AM. The cells were grouped as follows： control group, in which the viral medium was replaced by DMEM when HSCs were transfected with adenovirus; Ad-GFP group, in which HSCs were transfected with adenovirus expressing green fluorescent protein (GFP) alone; and Ad-PTEN group, in which HSCs were transfected with adenovirus harboring both wildtypePTENandGFPgenes.ResultsThe wild-typePTENwas successfully transduced into activated HSCs by adenoviral vector. The intracellular calcium ion concentration of the HSCs in the Ad-PTEN group significantly decreased compared with the control group and the Ad-GFP group (P＜ 0.05). However, no significant difference was observed in the intracellular calcium ion concentration of HSCs between the control group and the Ad-GFP group(P＞ 0.05).ConclusionsThe over-expression of wild-typePTENcan significantly reduce the intracellular calcium ion concentration in activated hepatic stellate cellsin vitro.

hepatic stellate cell;PTEN; intracellular calcium ion concentration

R575

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.28.003

1005-8982（2017）28-0012-04

2016-11-26

河北省自然科学基金（No：H2013209327）；中国肝炎防治基金会天晴肝病研究基金资助项目（No：CFHPC20132078）