两种ELISA试剂盒与血清中和试验检测牛赤羽病的比较

肖 妍,赵祥平,董志珍,张永年,王 勤,张俊哲,赵 丹,王建华

(1. 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心,天津 300461;2. 中国检验检疫生命科学研究院,北京 100123)

两种ELISA试剂盒与血清中和试验检测牛赤羽病的比较

肖 妍1,赵祥平1,董志珍1,张永年1,王 勤2,张俊哲1,赵 丹1,王建华1

(1. 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心,天津 300461;2. 中国检验检疫生命科学研究院,北京 100123)

为比较两种商品化赤羽病抗体ELISA试剂盒的敏感性和特异性,以及ELISA和微量血清中和试验(SNT)的符合率,采用两种ELISA试剂盒和血清中和试验,对690份澳大利亚纯种荷斯坦奶牛血清进行牛赤羽病检测.试验结果显示:法国某公司生产的赤羽病ELISA试剂盒敏感性为93.42%,特异性为81.23%,与SNT 间的Kappa值为0.615,为高度符合;日本某公司生产的赤羽病ELISA试剂盒敏感性为39.47%,特异性为96.1%,与SNT 间的Kappa值为0.427,为中度符合.比较结果表明:日本某公司生产的试剂盒敏感性较低,容易漏检,不适合用于牛赤羽病初筛;在出入境检疫中,可以采用高通量、半自动化、敏感性高的ELISA方法,对血清样本进行筛选,再采用特异性强的SNT试验进行辅助验证.

赤羽病;ELISA;微量血清中和试验;比较试验

赤羽病(Akabane disease,AKAD)又称阿卡斑病,是由布尼病毒属辛波(Simbu)病毒群的赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)引起牛、绵羊和山羊等动物发生的一种以流产、早产,产死胎、畸形胎、木乃伊胎,以及新生胎儿发生关节弯曲和积水性无脑综合征为临床特征的病毒性传染病.本病首次于1949年在日本群马县赤羽村发生;1961年在日本群马县赤羽村的畜舍内采集的两种蚊虫体内分离出病毒,并命名为赤羽病病毒[1].该病多发生于热带和温带,为虫媒性传染病,主要传播媒介是蚊和库蠓[2-3].澳大利亚、以色列、日本、肯尼亚、南非、印度尼西亚、马来西亚、非律宾都曾有本病的报道.我国也有在部分地区发现血清抗体阳性动物的报道,并于1998年首次报道分离鉴定出病毒[4-6].赤羽病是目前对养牛业和养羊业危害较为严重的疾病,是世界动物卫生组织(OIE)法定通报疾病,也是我国从国外进口牛、羊必须检测的疫病之一,是我国《进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》中的二类传染病.对赤羽病的诊断,很少采用病毒分离鉴定的方法,而是采用组织病理学和血清学方法,在进出口检疫中普遍采用血清学方法.ELISA和微量血清中和试验(SNT)为OIE 规定的国际贸易中牛羊赤羽病检疫指定试验.

1 材料

1.1 试验样本

为比较商品化赤羽病抗体ELISA试剂盒的敏感性和特异性,以及ELISA和SNT的符合率,本试验对690头澳大利亚纯种荷斯坦奶牛,于进入隔离场7 d后,分别逐头采集血样,分离血清,用于ELISA检测和微量血清中和试验检测.SNT用血清经56 ℃、30 min 灭活.

1.2 主要试剂与仪器

赤羽病ELISA试剂盒分别为日本某公司生产和法国某公司生产;微量血清中和试验所用细胞为Vero细胞;所用种毒为AKAV;AKAV阳性血清和阴性血清为澳大利亚EMAI 实验室惠赠;主要仪器有全自动酶标仪、自动洗板机.

2 方法

2.1 ELISA试验

分别用法国某公司生产的试剂盒(ELISA-1)和日本某公司生产的试剂盒(ELISA-2),对690份奶牛血清样品进行ELISA检测.方法按照试剂盒说明书操作.

2.2 微量血清中和试验

对690份奶牛血清样品进行微量血清中和试验检测.方法按照行业标准《赤羽病检疫技术规范》(SN/T 1128-2007)进行操作.

3 数据统计分析

3.1 敏感性(DSe)和特异性(DSp)计算

以SNT试验结果为基准,按照下列计算公式计算每种试剂盒的DSe和DSp,并对两种ELISA试剂盒进行评价.

计算公式:DSe = A/(A+C);DSp = D/(B+D)

表1 DSe和DSp数据统计

3.2 试剂盒与SNT间的Kappa值计算

按照下列公式计算试剂盒与SNT间的Kappa值,比较试剂盒与SNT的符合程度.

如果Kappa值在0.81～1,说明两个方法间完全符合;在0.61～0.8,为高度符合;在0.41～0.6,为中度符合;0.21～0.4,为比较符合;0.2以下为轻度符合;0以下为不符合.

表2 Kappa值计算数据统计

4 结果

本次测定结果显示,ELISA-1试剂盒(法国)的敏感性为93.42%,特异性为81.23%;ELISA-2试剂盒(日本)的敏感性为39.47%,特异性为96.1%(表3).结果表明,ELISA-2试剂盒的敏感性较低,容易漏检,不适合用于赤羽病的初筛检测.不同ELISA试剂盒与SNT 间的Kappa值计算结果见表4、表5.

表3 DSe、DSp测定结果

表4 ELISA-1(法国) 与SNT 单位:份

表5 ELISA-2(日本)与SNT 单位:份

5 讨论与结论

根据流行病学、临床症状及病理变化特征,可对赤羽病作出初步判断,但确诊需要进行实验室检验.赤羽病的实验室诊断方法分为病原学鉴定和血清学试验.目前在赤羽病出入境检疫或临床检疫时,通常采用ELISA和SNT进行检测.

由表3、表4、表5可知,法国某公司的ELISA试剂盒与SN试验相比敏感性为93.42%,特异性为81.23%,Kappa值为0.615,与SNT高度符合;日本某公司的ELISA试剂盒与SNT相比敏感性为39.47%,特异性为96.1%,Kappa值为0.427,与SN试验中度符合.

ELISA方法的敏感性高,SNT方法的特异性强.ELISA 方法会出现假阳性结果;SNT操作复杂,细胞易受污染,检测周期长,不适用于大批量动物血清样品的检测.因为日本某公司的ELISA试剂盒的敏感性较低,所以会出现漏检情况,不适合用于赤羽病的初筛检测.而法国某公司的ELISA 试剂盒与SNT高度符合,因此在出入境检疫中,可选用该试剂盒对血清样本进行ELISA筛选试验,再采用特异性强的SNT进行辅助验证.

[1] 徐淑菲,孔凡德. 赤羽病病原学研究进展[J]. 福建畜牧兽医,2005,27(5):25-26.

[2] 殷震,刘景华. 动物病毒学[M]. 2版. 北京:科学出版社,1997.

[3] 于大海,崔砚林. 中国进出境动物检疫规范[M]. 北京:中国农业出版社,1997.

[4]李昌林,封启民,张瑞珍,等. 我国赤羽病血清学调查报告[J]. 中国动物检疫,2000,17(7)27-29.

[5] 李其平,姚龙涛. 阿卡斑(赤羽病)病毒的分离与初步鉴定[J]. 塔里木大学学报,2008,20(3):103-106.

[6] KUROGI H,INABA Y,TAKAHASHI E,et al.Congenital abnormalities in newborn calves after inoculation of pregnant cows with Akabane virus[J]. Infection and immunity,1977,17(2):338-343.

[7] REINHOLD K,ANDREW M J M,PETER D K,et al.Evaluation of two commercial enzyme-linked immunorbent assay kits for the detection of serum antibodies against Akabane virus in cattle[J] Journal of veterinary diagnostic investigation,2013,25(5):645-648.

[8] 王玉瑾,吴雯娟,张婷,等. 赤羽病ELIS检测方法的建立及试剂盒的研制[J]. 养殖与饲料,2013(11):15-19.

[9] 顾晓,瞿慧,刘淡宁,等. 奉贤地区奶牛赤羽病血清学的调查[J]. 中国畜牧兽医文摘,2016,32(3):118.

(责任编辑:朱迪国)

Comparative Study of Two ELISA Kits and Serum Neutralization Test in Detecting Akabane Disease of Cattle

Xiao Yan1,Zhao Xiangping1,Dong Zhizhen1,Zhang Yongnian1,Wang Qin2,Zhang Junzhe1,Zhao Dan1,Wang Jianhua1
(1. Animal and Plant and Food Stuffs Inspection Center,Tianjin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Tianjin 300461;2. China Inspection and Quarantine Life Sciences Research Institute,Beijing 100123)

To compare the 2 commercial ELISA kits from the aspects of the diagnostic sensitivity(DSe),the diagnostic specificity(DSp),and the coincidence rate of ELISA and serum neutralization test(SNT),the Akabane disease detection was carried out towards 690 serum samples of cattle imported from Australia,by two ELISA kits and serum neutralization test. The results showed that the DSe of the ELISA kit from a French company was 93.42%,the DSp was 81.23% and the Kappa with SNT was 0.615,which was consistent highly. The DSe of the ELISA kit from a Japan company was 39.47%,the DSp was 96.1% and the Kappa with SNT was 0.427,which was consistent moderately. The comparative results showed that the DSe of kit produced by Japanese company was low,and it was easy to miss detection,which was unsuited for Akabane disease detection. In the entry and exit quarantine,a high throughput,semi-automated and highly sensitive ELISA method could be used to screen the serum samples,and the SNT test with high DSp was carried out to assist the verification.

Akabane disease;ELISA;micro-serum neutralization test;comparative test

S945.4

A

1005-944X(2017)12-0081-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.12.023

天津出入境检验检疫局科技计划项目(TK102-2013)