阿江榄仁酸对LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞的抗炎作用初步研究

权洪峰+闫欣+彭晓东

摘要：目的 探讨阿江榄仁酸对脂多糖（LPS）诱导的炎症反应的抗炎作用。方法 分别以5 μg/ml LPS和1、5、10、20、40、80和160 μmol/L阿江榄仁酸加入小鼠RAW 264.7细胞培养液培养24 h。采用MTT法测定细胞活力，Griess法检测一氧化氮（NO）的含量，ELISA法检测TNF-α和IL- 6水平。结果 阿江榄仁酸剂量在80 μmol/L时对细胞生存力无显著影响。阿江榄仁酸可显著降低LPS引起的NO，TNF-α和IL-6水平的升高。结论 阿江榄仁酸对LPS诱导的炎症反应有抗炎作用。

关键词：阿江榄仁酸；炎症；一氧化氮；TNF-α

中图分类号：R96 文献标识码：A 文章编号：1006-1959（2017）23-0030-03

Preliminary Study on the Anti-inflammatory Effect of Azartipic Acid on LPS-induced Mouse RAW264.7 Macrophages

QUAN Hong-feng1，YAN Xin2，PENG Xiao-dong1

（1.School of Pharmacy，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia，China；

2.Department of Pharmacy，the First People's Hospital of Yinchuan 750004；Ningxia，China）

Abstract：Objective To investigate the antiinflammatory effect of azartipic acid on lipopolysaccharide（LPS）induced inflammatory response.Methods The mice were cultured with 5 μg/ml LPS and 1，5，10，20，40，80 and 160 μmol/L azartiprofen acid respectively in RAW 264.7 cell culture medium for 24 h.The cell viability was determined by MTT assay.The content of nitric oxide（NO）was measured by Griess method，and the levels of TNF-α and IL-6 were detected by ELISA.Results There was no significant effect on the cell viability at 80 μmol/L.Azartic acid can significantly reduce the levels of NO， TNF-α and IL-6 induced by LPS.Conclusion Azinolinic acid has anti-inflammatory effect on LPS-induced inflammatory response.

Key words：Azartic acid；Inflammation；Nitric oxide；TNF-α

炎症是一种应对感染或组织损伤的正常和有益的自我保护反应。在炎症发生的初期，大量炎症介质被释放，最终使组织恢复正常结构和功能。然而，持续或慢性炎症会继发许多慢性疾病，如心血管疾病及糖尿病[1-3]。脂多糖（LPS）常用于建立体外巨噬细胞在炎症模型进而评价天然产物的抗炎作用。LPS可诱导促炎细胞因子（TNF-α，IL-6）的表达，以及许多其他介质的高表达，如 NO[4-5]。三萜类化合物具有广泛的生物活性，如降血糖、抗肿瘤及抗炎作用[6-7]。本课题深入研究了阿江榄仁酸的抗炎作用，旨在为其研发提供实验依据。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1仪器 CO2恒温培养箱（Thermo公司）；酶标仪（芬兰雷勃酶标仪公司）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf）。

1.1.2材料与试剂 阿江欖仁酸（CAS：465-00-9，上海源叶生物科技有限公司）小鼠RAW 264.7巨噬细胞株（中国科学院上海生命科学研究院）；青霉素/链霉素（南京凯基生物技术发展有限公司）；二甲亚砜（DMSO）（美国Corning公司）；MTT、LPS、Mouse NO试剂盒（美国Sigma公司）；Mouse TNF-α，IL-6 ELISA试剂盒（Bio Swamp公司）。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 小鼠巨噬细胞RAW264.7培养于5% CO2、37 ℃培养箱中，用含100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素、10%热灭活胎牛血清的RPMI-1640培养液传代培养。实验用细胞均处于对数生长期。细胞接种于96 孔培养板中，接种密度为1.5×104细胞/孔。实验设计为空白对照组（不加LPS），模型对照组（加入LPS）、阳性对照组（雷公藤红素，0.5 μmol/L）、阿江榄仁酸组（1，5，10，20，40， 80，160 μmol/L），培养24 h后，吸取上清液，检测细胞生存率，以及NO、TNF-α和IL-6的水平。

1.2.2细胞生存率检测 RAW 264.7细胞液接种于96孔培养板中，接种密度为1.5×104细胞/孔，贴壁生长24 h后，加入 5 μg/ml LPS和不同浓度阿江榄仁酸。培养24 h后，每孔加入20 μl MTT溶液，于37 ℃继续培养4 h。4 h后弃掉MTT溶液，每孔加150 μl DMSO溶解沉淀，在570 nm测定OD值。endprint

1.2.3 Griess法檢测NO含量 RAW 264.7细胞液接种于96孔培养板中，接种密度为1.5×104细胞/孔，贴壁生长24 h。24 h后加入阿江榄仁酸（1，5，10，20，

40，80，160 μmol/L）、雷公藤红素（0.5 μmol/L）并分别加入LPS（5 μg/ml）培养24 h。培养后在40 μl/孔的细胞上清液中加入40 μl的Griess反应试剂。在570 nm下测定OD值，计算NO含量。

1.2.4 ELISA法检测TNF-α及IL-6表达量 按照试剂盒说明分别检测TNF-α及IL-6的表达水平。

1.3统计学方法

实验数据均以means±SD来表示，采用统计软件SPSS19.0和作图软件Graphpad prism 5对所得数据进行统计与处理，统计方法采用单因素方差分析（One-way ANOVA），以P<0.05表示存在显著性差异。

2 结果

2.1阿江榄仁酸药物浓度的筛选

在加入LPS及不同给药浓度后，以MTT法检测阿江榄仁酸对细胞生存力的影响，结果显示阿江榄仁酸不同浓度（0，1，5，10，20，40，80，160 μmol/L）处理组无统计学差异（见图1），表明阿江榄仁酸浓度在80 μmol/L范围内细胞生存力均>90%。

2.2阿江榄仁酸对 LPS诱导的 NO含量的影响

采用Griess法检测NO的表达量。结果表明，加入LPS后的细胞液中NO的含量显著升高，而阿江榄仁酸给药组可以使升高的NO含量降低，并与剂量呈正相关性（P<0.05）。阿江榄仁酸给药浓度为40 μmol/L和80 μmol/L时，对NO的含量的抑制率可达到50%（见图2）。

2.3阿江榄仁酸对 LPS诱导的炎性细胞因子含量的影响

采用ELISA试验检测炎性细胞因子TNF-α和IL-6的表达量。结果显示，加入LPS后的细胞液中TNF-α（见图3A）和IL-6（见图3B）的表达量显著升高，而阿江榄仁酸给药组能够剂量依赖性地使升高的炎性细胞因子含量降低（P<0.05）。

3 讨论

巨噬细胞是一种广泛分布在炎症中其重要作用的先天免疫细胞[8]。LPS通过其脂质成分可以作用于包括巨噬细胞在内的多种细胞，在LPS的诱导下，巨噬细胞被激活而导致炎症介质（TNF-α，IL-6）的释放[9]。因此，LPS-诱导RAW 264.7巨噬细胞产生炎症反应的模型被广泛用于抗炎药物的筛选[10]。IL-6是一个潜在的炎性细胞因子介导许多重要的生理功能，特别是急性和慢性炎症[11]。TNF参与多种细胞生理过程，包括细胞存活、细胞凋亡和坏死。在本研究中，LPS能促炎细胞因子TNF-α和IL-6的水平显著增加，而阿江榄仁酸可逆转由LPS引起的TNF-α和IL-6的高表达。这些结果表明，阿江榄仁酸对LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症具有保护作用。

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