慢性乙型肝炎及乙型肝炎性肝硬化患者色氨酸代谢变化及其相关性分析

班艳娜，甄乾娜，邓琳琳，何一帆，丁 敏△

(1.重庆医科大学附属第一医院生殖健康与不孕症专科实验室 400016;2.重庆医科大学附属第一医院内分泌实验室 400016;3.重庆医科大学检验医学院/临床检验诊断学教育部重点实验室 400016)

论著·临床研究

慢性乙型肝炎及乙型肝炎性肝硬化患者色氨酸代谢变化及其相关性分析

班艳娜1，甄乾娜2，邓琳琳3，何一帆3，丁 敏3△

(1.重庆医科大学附属第一医院生殖健康与不孕症专科实验室 400016;2.重庆医科大学附属第一医院内分泌实验室 400016;3.重庆医科大学检验医学院/临床检验诊断学教育部重点实验室 400016)

目的探讨慢性乙型肝炎(CHB) 和乙型肝炎性肝硬化(HBC)患者色氨酸(Trp)代谢变化及相关性。方法选取2015年10月至2016年1月在重庆医科大学附属第一医院住院的CHB 81例和HBC 40例患者为研究对象，40例健康者为对照。采用高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FD)对各组受试者血浆中Trp及代谢产物犬尿氨酸(Kyn)、5-羟色胺(5-HT)水平进行测定，实时荧光定量PCR检测HBV-DNA病毒复制数，分析3组间血清学指标差异，采用Pearson相关分析和Logistic回归分析筛选危险因素。结果与对照组比较，CHB组、HBC组受试者血浆中Trp和5-HT水平明显降低(Plt;0.01);HBC组受试者血浆中Kyn/Trp明显高于其他两组(Plt;0.01)。HBC组Kyn/Trp与A/G呈负相关(r=-0.686，Plt;0.01),CHB组Kyn/Trp与Log DNA呈正相关(r=0.784,Plt;0.01)。Logistic回归分析显示Kyn/Trp为CHB和HBC的危险因素。结论检测血浆中Trp及其代谢产物可作为辅助指标评估乙型肝炎进展情况。

色氨酸；犬尿氨酸；5-羟色胺；乙型肝炎；乙型肝炎性肝硬化

我国约有2亿人患有慢性乙型肝炎(CHB)，其中30%的患者会发展为乙型肝炎性肝硬化(HBC)[1]，甚至肝癌。研究表明，机体中乙型肝炎病毒介导的免疫耐受和病毒载量与吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)相关[2]。IDO可通过降解外周细胞中的色氨酸(Trp)生成犬尿氨酸(Kyn)及其衍生物，同时可经Trp加氧酶生成5-羟色胺(5-HT)[3]。有研究报道CHB患者中IDO高表达[4]，Trp在CHB和HBC患者中代谢变化尚不明确。本文探讨CHB和HBC患者Trp代谢变化及其相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年10月至2016年1月在重庆医科大学附属第一医院住院的CHB和HBC患者为研究对象。CHB组81例，男43例，女38例，平均年龄(45.89±12.60)岁；HBC组40例，男29例，女11例，平均年龄(46.05±12.52)岁；40例健康者为对照组，男21例，女19例，平均年龄(45.29±7.30)岁。纳入标准：(1)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[5];(2)既往有乙型肝炎病毒史或者HBsAg阳性超过6个月，现在HBsAg和HBV-DNA仍为阳性；(3)结合病史中影像学、生物学或者血清学检查肝细胞合成障碍或者门静脉高压症，或组织学符合肝硬化诊断。排除标准：(1)合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒重叠感染；(2)合并脂肪肝及酒精性肝病；(3)最近半年以来未接受抗病毒、免疫及精神症状治疗；(4)合并严重心、肾、内分泌、其他自身免疫性疾病及血液系统疾病；(5)妊娠或哺乳期妇女。本研究经重庆医科大学附属第一医院伦理委员会批准(2013-24)，受试者均签署知情同意书。

表1 3组受试者临床资料及实验室指标

-:此项无数据

图1 各组受试者血浆中Trp及其代谢物水平比较

1.2方法

1.2.1仪器和试剂 Shimadzu 2010L高效液相色谱仪(日本Shimadzu 公司)，配紫外检测器和Class-VP 色谱工作站；日立全自动分析仪 (RL7600-110)；实时荧光定量PCR(Roche cobas z480)；天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、清蛋白(Alb)、前蛋白(PA)和总蛋白(TP)检测试剂和生化复合校准品(四川迈克生物科技股份有限公司)；标准品Kyn、Trp、5-HT均为色谱纯(美国Sigma公司)。

1.2.2样品采集与生化指标检测 清晨空腹采血，分离血清，测定AST、ALT、PA、Alb、TP水平。采用实时荧光定量PCR进行HBV-DNA检测(试剂盒由湖南圣湘生物科技有限公司提供)。同时用肝素抗凝管采取2 mL，于 4 ℃、2 000×g离心分离血浆，置于-20 ℃冰箱内保存，用于Trp及代谢产物的检测。

1.2.3高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FD)[6]检测血浆Trp、Kyn、5-HT水平 取血浆100 μL，加入15 μL内标溶液(300 μmol/L茶碱)和10 μL 35%高氯酸溶液，涡漩混匀1 min，15 000×g、4 ℃离心10 min，沉淀蛋白，取上清液25 μL进样分析。色谱条件:色谱柱为BDS-Hypersil-C8柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相为10 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH 4.5)∶乙腈 (94∶6,v/v)，柱温25 ℃，流速0.6 mL/min。紫外检测程序波长为0～5.5 min,360 nm；5.6～6.0 min,220 nm；6.1～7.0 min,302 nm；7.1～8.0 min,360 nm。该方法日内相对标准偏差0.80%～3.45%,日间相对标准偏差1.21%～14.89%。平均回收率87%～113%。

2 结 果

2.1临床资料及实验室指标 3组受试者年龄和性别比较差异无统计学意义(Pgt;0.05)，AST、ALT、PA、Alb、TP、A/G在两组间比较差异均有统计学意义(Plt;0.05)。见表1。

2.2各组受试者Trp及其代谢分析 CHB组和HBC组受试者血浆中5-HT和Trp水平低于对照组(Plt;0.01)；HBC组受试者血浆中Kyn/Trp较其他两组明显升高(Plt;0.01)。见图1。

2.3线性逐步回归及相关性分析 在CHB组中，以5-HT、Kyn和Trp为自变量，HBV-DNA为因变量进行线性逐步回归分析，仅Trp和Kyn进入方程，相关系数0.833，回归方程：Y=5.377-0.156X1(Trp)+4.228X2(Kyn),F=55.19,P=0.000。HBC组Trp、Kyn和5-HT(自变量)与A/G(因变量)进行线性逐步回归分析,结果显示仅Trp和Kyn进入方程，相关系数0.784,回归方程：Y=0.092+0.030X1(Trp)-0.612X2(Kyn),F=15.74,P=0.000。Person相关分析显示：CHB组中Kyn/Trp与Log DNA呈正相关(r=0.784,Plt;0.01),在HBC组中Kyn/Trp与A/G呈负相关(r=-0.686,Plt;0.01)。见图2。

2.4危险因素的单因素分析 对可能影响CHB和HBC的5-HT、Kyn、Trp和Kyn/Trp危险因素进行单因素分析，以是否患有CHB或HBC为因变量，分别以5-HT、Trp、Kyn和Kyn/Trp为自变量，进行二元Logistic回归分析。结果显示两组间5-HT、Trp、Kyn/Trp均有特异性差异(Plt;0.05)。Kyn/Trp为CHB和HBC患者的独立危险因素。见表2。

A：HBC组Kyn/Trp与A/G相关性；B：CHB组Kyn/Trp与Log DNA相关性

图2 线性逐步回归及相关性分析表2 CHB和HBC患者危险因素单因素分析

3 讨 论

乙型肝炎病毒入侵肝细胞后，其本身并不直接引起肝细胞病变，而是其在肝细胞内复制并激发人体的免疫系统，这种肝细胞内的免疫反应可对肝细胞造成损伤和破坏。文献报道，HBC患者中IDO高表达引起Trp降解和抑制机体T细胞,Kyn/Trp间接反映出IDO的活性[4]。本研究结果显示CHB组Kyn/Trp与Log DNA呈正相关(r=0.784),表明乙型肝炎病毒载量可与机体的免疫机制有关。乙型肝炎病毒入侵后，在机体的免疫系统调节下，病毒暂时减缓或停止复制,免疫反应就会较弱或停止,对肝细胞的损害也就相应较轻,血清中HBV-DNA水平及转氨酶维持在较低或正常水平,但在某些诱因下,平衡条件改变,病毒在宿主体内活动活跃,此时宿主的细胞免疫和体液免疫应答加强[7],以攻击患者肝细胞内的大量病毒,肝细胞也随之受到损害。因此，ALT/AST仅仅反映肝细胞受损情况，与机体的免疫调节无关，而Kyn/Trp更能确切地反映出机体的免疫状态。

IDO通常被认为是免疫激活指示器，参与肿瘤免疫耐受，尤其在全身免疫耐受中起着至关重要的作用。文献报道，CHB感染后会促进IDO的高表达[8-9]。实验表明，乙型肝炎病毒感染后巨噬细胞在γ-干扰素(IFN-γ)及来自活化T细胞的诱导下可以表达IDO[10]，在Trp缺乏的环境下T细胞将无法活化与克隆增殖，而且这种T细胞增殖一旦被抑制将很难被再次激活，从而IDO上调可能会促使丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒逃避T细胞免疫。本试验结果显示，与对照组相比，CHB组和HBC组受试者Trp、Kyn水平都发生了变化。HBC患者中Kyn/Trp比CHB组更高。由此可以看出，Trp代谢在乙型肝炎病毒介导的肝脏疾病中发生了变化，这种变化可能与乙型肝炎病毒介导的免疫耐受有关。

乙型肝炎病毒感染机体后，通过免疫系统激活T细胞分泌IFN-γ及细胞毒性T细胞来保护肝细胞受损，但IFN-γ分泌会激活IDO活性来削弱抗原提呈细胞的功能，从而使T细胞功能丧失[11-12]。同时Trp降解产生的代谢产物Kyn也可以直接抑制T细胞功能，诱导正经历活化阶段的T细胞凋亡。这样的作用会导致机体处于免疫抑制状态，造成肝脏功能严重障碍。本研究显示，HBC患者Kyn/Trp与A/G呈负相关(r=-0.686)，说明HBC患者激活的IDO加速Trp代谢降解，Kyn/Trp增大，导致肝脏免疫功能抑制更严重，肝脏合成清蛋白功能减弱，球蛋白代偿性的增加，A/G倒置。

目前IDO在多种肿瘤中高表达，IDO诱导肿瘤免疫耐受机制的研究表明，主要抑制T细胞增殖达到逃避免疫监视的目的，从而促使肿瘤细胞增殖和侵袭转移[13]。HBC组Trp水平明显低于CHB组，Kyn/Trp高于CHB组，并且Logistic回归分析显示Kyn/Trp均为CHB和HBC的危险因素。因此对这两种疾病的患者评估Kyn/Trp 相当重要。同时也说明乙型肝炎病毒感染引起机体免疫损伤HBC组比CHB组更严重，从而出现两组Kyn/Trp特异性差异，HBC患者中Kyn/Trp反映IDO处于高表达状态，也可以提示患有肿瘤的风险。

5-HT是一种调节心情变化的神经递质，脑脊液中5-HT水平降低会引起抑郁症。有研究发现，肝硬化患者有较高的比例患有抑郁倾向，抑郁症严重性与肝脏损坏程度相关[14]。本试验结果显示，CHB和HBC患者5-HT的水平与对照组比较均显著性降低，表明5-HT与HBV患者抑郁症状有关，这一结果与文献报道一致[15]。

综上所述，Trp及代谢物在CHB和HBC患者中发生了显著性变化，并且Kyn/Trp在这两种疾病中均为危险因素，检测Trp及其代谢物可能成为一个新的评估乙型肝炎进展的潜在辅助指标。

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TryptophanmetabolismchangeinpatientswithchronichepatitisBandhepatitisBcirrhosisanditscorrelationanalysis*

BanYanna1,ZhenQianna2,DengLinlin3,HeYifan3,DingMin3△

(1.LaboratoryofHealthReproductionandInfertility;2.DepartmentofEndocrinologyLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;3.KeyLaboratoryofDiagnosticMedicineofMinistryofEducation,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

ObjectiveTo investigate the tryptophan (Trp) metabolism change in the patients with chronic hepatitis B (CHB) and hepatitis B cirrhosis (HBC) and to analyze the related risk.MethodsEighty-one cases of CHB and 40 cases of HBC hospitalized in the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University from October 2015 to January 2016 served as the study subjects,and 40 healthy persons as the controls.High performance liquid chromatography -fluorescence detection (HPLC-FD) were adopted to detect the levels of plasma Trp,kynurenine (Kyp) and its metabolite 5-hydroxy tryptamine (5-HT).HBV-DNA viral replication number was detected by real-time quantitative PCR.The serological indicators differences among 3 groups were analyzed.The risk factors were analyzed and screened by the Logistic regression analysis and Pearson correlation analysis.ResultsCompared with the control group,plasma 5-HT and Trp levels in the CHB group and HBC group were significantly decreased(Plt;0.01);plasma Kyn/Trp in the HBC group was significantly higher than that in the other two groups(Plt;0.01).Kyn/Trp in the HBC group was negatively correlated with A/G (r=-0.686，Plt;0.01),and Kyn/Trp in the CHB group was positively correlated with Log DNA (r=0.784,Plt;0.01).The Logistic regression analysis indicated that Kyn/Trp was the risk factor of CHB and HBC.ConclusionDetecting plasma Trp and its metabolite can serve as the adjuvant indicators for assessing the progression of hepatitis B.

tryptophan;kynurenine;5-hydroxy tryptamine;chronic hepatitis B;hepatitis B cirrhosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.33.005

国家自然科学基金资助项目(81200294)。

班艳娜(1986-)，初级检验技师，硕士，主要从事分析化学研究。△

,E-mail：dingmin@cqmu.edu.com。

R-33

A

1671-8348(2017)33-4622-03

2017-05-10

2017-07-17)