对称性肢端角化病超微结构变化及角蛋白1的表达研究

李荣华,李笑梅，孙娟娟，游晓意,庄永灿,李红杏，官飞凤，李常兴△

(1.福建医科大学附属泉州第一医院皮肤科,福建泉州 362000；2.广东省东莞市第六人民医院皮肤科 523008)

论著·临床研究

对称性肢端角化病超微结构变化及角蛋白1的表达研究

李荣华1,李笑梅2，孙娟娟2，游晓意1,庄永灿1,李红杏2，官飞凤2，李常兴2△

(1.福建医科大学附属泉州第一医院皮肤科,福建泉州 362000；2.广东省东莞市第六人民医院皮肤科 523008)

目的探讨对称性肢端角化病(SAK)皮损超微结构变化及角蛋白(KRT)1的表达。方法选取福建医科大学附属泉州第一医院及东莞市第六人民医院门诊SAK患者13例为研究对象，组织病理标本取材于手腕部位，皮损组织取材前2个月内均未外用维甲酸制剂或皮质类固醇制剂或中药制剂。健康对照皮肤为整形美容手术切除正常皮肤12例。采用透射电镜观察SAK患者皮损超微结构变化，免疫组化法检测13例SAK患者皮损及12例健康者皮肤组织中KRT1的表达。结果SAK患者皮肤组织超微结构表现为角质化包膜连续性中断,角质层、棘层上部和颗粒层细胞核周围角蛋白丝显著聚集。KRT1在SAK皮损及正常皮肤组织中棘层、颗粒层及角质层均有表达，胞质及胞膜染色多见；KRT1在SAK皮损组织中表达明显高于正常皮肤(t=2.210,P=0.038)。结论SAK皮损超微结构特点为表皮角蛋白丝分化异常，可能与KRT1过表达有关。

角蛋白1；对称性肢端角化病；超微结构

对称性肢端角化病(SAK)是新报道的肢端角化病皮肤病，皮疹有明显的季节性变化，患者皮损水分丢失明显，皮脂缺乏，皮肤屏障功能障碍[1-6]。然而，SAK的发病机制尚未清楚，本研究探讨SAK的超微结构特点及角蛋白(KRT)1在SAK患者皮损组织的表达，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取福建医科大学附属泉州第一医院及东莞市第六人民医院门诊SAK患者13例为研究对象，其中女2例，男11例，年龄18～39岁。组织病理标本取材于手腕部位，皮损组织取材前2个月内均未外用维甲酸制剂或皮质类固醇制剂或中药制剂。健康对照皮肤为整形美容手术切除正常皮肤12例，其中女2例，男10例，年龄16～40岁。13例SAK患者中取1例男性患者进行透射电镜检查。本研究经医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1主要试剂 KRT1抗体(UK，abcam，ab111471)；Envision，anti-rabbit/mouse-HRP(Denmark,DAKO),DAB染色液(Denmark，DAKO，K5007)。

1.2.2采用透射电镜观察SAK患者皮损超微结构变化 皮损组织：置于3%戊二醛溶液4 ℃前固定2～4 h，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗10 min，连续2次。后固定：1%锇酸1.5～2.0 h，0.1 mol/L PBS漂洗5 min，连续2次。脱水：50%、70%乙醇逐级脱水，每级10 min，80%、90%、100%丙酮逐级脱水，每级10 min，连续2次。包埋：标本放入100%丙酮∶环氧树脂Epon 812包埋剂(1∶1)混合40 min，环氧树脂Epon 812包埋剂37 ℃浸透过夜，包埋60 ℃、48 h。修剪组织块：显微镜下将组织块修成正方形。镜下定位：在AO超薄切片机下切1 μm的半薄切片，HE染色定位。超薄切片：在AO超薄切片机下切40～60 nm的超薄切片，铜网捞片。染色：70%乙醇配制的饱和醋酸铀染色3 min，双蒸水漂洗，铅染液染3 min，双蒸水漂洗。

1.2.3免疫组化法检测皮肤组织中KRT1的表达 脱蜡和水化，二甲苯浸泡10 min×2次，无水乙醇梯度脱水，PBS清洗5 min×2次。切片置于室温封闭5～10 min，PBS清洗2 min×3次，抗原修复，PBS洗5 min。滴加封闭液，室温，10 min。滴加一抗KRT1抗体(工作液稀释比例1∶300)，室温1 h或者4 ℃过夜或者37 ℃ 1 h(4 ℃过夜后在37 ℃复温45 min)，PBS清洗2 min×3次。滴加羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体，37 ℃孵育30 min,DAB显色，蒸馏水洗，苏木素复染45 s。50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇中脱水，每次2 min。置于100%二甲苯10 min，中性树脂50 μL封片，室温保存。

1.2.4结果判读 光镜下观察角质形成细胞内KRT1阳性细胞,阳性切片随机选取5个200倍视野摄片。

1.2.5半定量分析 采用ImagePro plus(IPP)软件进行观察分析结果。

2 结 果

2.1典型病例 患者临床表现为双手腕，双指背、双掌背、双足背见棕褐色斑丘疹，见图1。组织病理学表现为表皮呈明显网篮状角化过度，棘层肥厚；真皮浅层毛细血管扩张，管周可见少量淋巴细胞浸润，见图2。基底层黑素颗粒增多。棘层上部和颗粒层细胞核周围角蛋白张力微丝聚集形成不连续性环状；颗粒层可见角蛋白丝、张力丝在核周凝集；桥粒连接结构正常；角质层明显增厚，排列松散，角质化包膜连续性中断，角蛋白丝显著凝集，见图3。

图1 典型病例

2.2免疫组化法 KRT1蛋白在健康人皮肤组织角质形成细胞中角质层、颗粒层和棘层均有中高强度的表达，主要位于胞质和包膜位置。KRT1蛋白在SAK患者皮损组织中角质层、颗粒层及棘层有较高强度的表达，主要位于胞质和包膜位置。KRT1在SAK皮损及正常皮肤组织阳性染色PU值分别为0.217 6±0.024 4和0.199 5±0.016 1，差异有统计学意义(t=2.210,P=0.038)。见图4。

图2 组织病例学表现(HE×100)

图3 超微结构(×8 000)

A：正常皮肤组织；B：皮损组织

图4 KRT1在皮损和正常皮肤组织中的表达(DAB×100)

3 讨 论

SAK临床特征为棕褐色或棕黑色斑疹、斑丘疹，角化过度，界限清楚，皮肤干燥，皮肤屏障功能受损，常伴发寻常型鱼鳞病[1,3]。典型的组织病理学特点为表皮网篮状角化过度，棘层增厚，表皮突向下延伸，真皮浅层少量淋巴细胞浸润，汗腺丰富。患者的病理形态学表现为表皮网篮角化过度，棘层增厚，真皮浅层少量淋巴细胞浸润[2,5]，提示病变主要在表皮，特别是角质层和棘层。皮损超微结构的特点为角质层增厚，角蛋白丝紊乱，角质层和棘层更加明显，符合SAK超微结构典型表现[6-7]。本研究结果显示，患者皮损组织超微结构变化符合组织病理学形态学变化。SAK的临床表现、组织病理学和超微结构变化提示角蛋白分化异常可能参与SAK的发病。

皮肤正常的角化过程是从基底层角质形成细胞开始，逐步分化成棘层细胞、颗粒层细胞、角质层细胞。基底层细胞在增殖过程中不断地向表面移动。KRT在皮肤角化过程中起重要作用，它是上皮细胞生长、分化及成熟的特征性标志物,保证细胞完整的理化性质和代谢过程顺利进行。KRT在表皮各层的表达有差异，基底层表达KRT5/KRT14,颗粒层表达KRT2e,而KRT1表达表皮绝大部分的棘层和角质层，因而，KRT1常被作为表皮正常分化的标志物[8-11]。根据病理学特点和超微结构特征，笔者推测KRT1可能参与了SAK的发病过程。免疫组化结果显示，KRT1蛋白在正常皮肤组织角质形成细胞中角质层、颗粒层和棘层均有中高强度的表达，主要位于胞质和包膜位置，KRT1蛋白在SAK患者皮损组织中角质层、颗粒层及棘层有较高强度的表达，主要位于胞质和包膜位置，表达强度较正常皮肤明显增强，特别是角质层和棘层。这些研究结果符合组织病理学和超微结构的变化，提示KRT1表达分化异常可能参与了SAK的发病。

[1]李常兴,韩春雷.对称性肢端角化病62例临床分析[J].中华皮肤科杂志,2013,46(7):505-506.

[2]李常兴,韩春雷.对称性肢端角化病临床病理分析[J].中华病理学杂志,2013,42(8):549-550.

[3]Li CX,Han CL,Zeng K,et al.Clinical,demographic and histopathological features of symmetrical acral keratoderma[J].Br J Dermatol,2014，170(10):948-951.

[4]李常兴,李红杏,官飞凤,等.对称性肢端角化病皮肤屏障功能评价及意义[J].广东医学,2015,36(21):3340-3341.

[5]田歆,周欣,张三泉,等.季节性对称性肢端角化症29例临床分析[J].中国麻风皮肤病杂志,2009,25(9):668-669.

[6]田歆,刘玉梅,张三泉,等.16例季节性对称性肢端角化症临床及病理超微结构分析[J].皮肤性病诊疗学杂志,2014,21(2):108-111.

[7]Li CX,Wen J,Zeng K,et al.Ultrastructural study of symmetrical acral keratoderma[J].Ultrastruct Pathol,2014,38(6):420-424.

[8]Chen L,Wang Y,Zhao L,et al.Hsp74,a potential bladder cancer marker,has direct interaction with keratin 1[J].J Immunol Res,2014,2014:492849.

[9]刘玮.皮肤屏障功能解析[J].中国皮肤性病学杂志,2008,22(12):758-761.

[10]Moravcová M,Libra A,Dvoáková J,et al.Modulation of keratin 1,10 and involucrin expression as part of the complex response of the human keratinocyte cell line HaCaT to ultraviolet radiation[J].Interdiscip Toxicol,2013,6(4):203-208.

[11]李常兴,李雪梅,张锡宝,等.寻常型鱼鳞病患者中间丝聚合蛋白及其基因的改变[J].中华皮肤科杂志,2014,47(4):19-22.

Studyonultramicrostructurechangeandkeratin1expressioninpatientswithsymmetricalacralkeratoderma*

LiRonghua1,LiXiaomei2,SunJuanjuan2,YouXiaoyi1,ZhuangYongcan1,LiHongxing2,GuanFeifeng2,LiChangxing2△

(1.DepartmentofDermatology,FirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Quanzhou,Fujian362000,China;2.DepartmentofDermatology,DongguanMunicipalSixthPeople′sHospital,Dongguan,Guangdong523008,China)

ObjectiveTo study the ultramicrostructure change and keartin(KRT1) expression in skin lesion of symmetrical acral keratoderma(SAK).MethodsThirteen cases of SAK in the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University and the outpatient department of the Dongguan Municipal Sixth People′s Hospital were selected as the study subjects.The histopathological samples were taken from the wrist site.The retinoic acid preparation or corticosteroid preparation or Chinese medicine preparation were not externally used within 2 months before taking skin lesion sample.The healthy control skin samples were the normal skin in 12 cases by plastic surgical resection.The ultramicrostructural change were observed by the transmission electron microscopy.The KRT1 expression in skin lesion of 13 cases of SAK and healthy skin tissue of 12 cases were measured by immunohistochemistry method.ResultsThe SAK ultramicrostructures manifested by the interruption of keratinizing envelope continuity in horny layer,and remarkable aggregation of keratin filament in upper stratum spinosum and surrounding nucleus of granular layer.KRT1 was expressed in the cells of SAK skin lesion and basal layer,spinous layer,granular layer and horny layer.The cytoplasm and cytomembrane staining was common.The KRT1 expression in skin lesion was significantly higher than that in normal skin(t=2.210,P=0.038).ConclusionThe ultramicrostructure features of SAK skin lesion are abnormal differentiation of epidermis keratin filaments,which might be related with overexpression of KRT1.

keartin-1；symmetrical acral keratoderma;ultramicrostructure

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.33.008

广东省医学科学技术研究基金资助项目(A2016025)；东莞市社会科技发展资助项目(2014108101008)；泉州市科技计划资助项目(2015Z39)。

李荣华(1976-)，副主任医师，本科，主要从事皮肤病的研究。△

,E-mail:lilichangxing@163.com。

Q954.539

A

1671-8348(2017)33-4630-03

2017-05-17

2017-07-21)