实验条件对宣城水体中藻蓝蛋白提取结果的影响

罗 赟 王子琬 席慕凡

（合肥工业大学 安徽宣城 242000）

实验条件对宣城水体中藻蓝蛋白提取结果的影响

罗 赟 王子琬 席慕凡

（合肥工业大学 安徽宣城 242000）

通过改变不同的实验条件，研究从蓝藻中提取藻蓝蛋白的最佳条件，以实现蓝藻的资源化利用。以宣城水体的新鲜秋季蓝藻水华为研究对象，利用液氮和50℃恒温水浴，通过反复冻融法提取藻蓝蛋白。以光谱吸收特征和浓度值为评价指标，研究和比较了不同冻融介质（磷酸盐缓冲液和乙醇溶液）和不同稀释比例（0.4，0.5,0.67，1）对藻蓝蛋白的提取效果的影响。结果表明：以0.1mol/l磷酸盐缓冲液作提取剂的藻蓝蛋白提取效果比100%乙醇好；稀释比例对藻蓝蛋白的提取效果的影响与提取介质有关。

蓝藻，藻蓝蛋白，反复冻融法

引言

由于污染物的排放，河流或湖泊中总氮和总磷的含量过高，水体富营养化状况日益严重，在高温的季节，易爆发蓝藻，导致水生动植物的死亡。目前，常见处理水华蓝藻的方法有：尽量控制外源性（点源、面源）营养物质输入；削减内源性营养物质的负荷；水华爆发前后应急除藻抑藻。机械和人工打捞是治理蓝藻的重要应急措施，但打捞上岸的蓝藻处置不当会造成二次污染。虽然在特定的条件下发挥了一定的作用，但是总的说来大多数措施往往旷日持久、耗资巨大、收效甚微，因此探究快速、高效、经济的新型治理方法显得尤为重要。

国内外关于蓝藻资源化利用主要有如下研究和开发：(1)厌氧发酵，采用蓝藻厌氧发酵技术生产沼气和肥料；(2)好氧堆肥，主要包括蓝藻堆肥和蓝藻直接做肥料；(3)提取藻蓝蛋白(C-phycocyanin，C-PC)等生物活性物质；(4)蓝藻饲料化，主要包括蓝藻处理后加工成饲料或提取氨基酸作为饲料添加剂等[1]。目前，蓝藻资源化的主要途径有两种，一是制沼气，二是制肥料。这两种途径适合处理大规模暴发的蓝藻，但其产品(沼气和肥料)附加值较低，经济效益仅与处理成本持平，这也是目前难以进行市场化推广的根本原因。本研究以打捞蓝藻资源化利用为目标，开展蓝藻藻蓝蛋白提取的技术研究。

目前细胞破碎的主要方法有超声波破碎法、反复冻融法、溶胀法、研磨法、化学试剂处理法及高压均质法等，Bennett[2]等用反复冻融法来破碎藻细胞，张静等对比反复冻融法、超声波法、溶胀法、丙酮法的提取效果，得到反复冻融法提取的提取效果优于其他3种方法。细胞破碎方法众多，且各有优缺点，超声波破碎法易产生高温引起PC变性，溶胀法提取周期较长，化学试剂法易产生污染等。由于液氮温度较低，可达-196℃，冷冻效果好、时间短，且反复冻融法过程中，可以做到避免光解、不易污染，人为干扰最小，能保证测定的准确性。因此本文选用液氮反复冻融法作为细胞破碎方法[3]，以光谱吸收特征和藻蓝蛋白浓度为评价指标，研究了不同冻融介质对藻蓝蛋白的提取效果的影响。

1 材料与方法

1.1 样品采集

水样采自于宛陵湖湖区表层30 cm水体，采集日期为2016年11月23号。采样期间天气晴朗，水体pH值为7.3。风力为微风。水样采集后放入采样瓶内运回实验室立刻进行分析。

1.2 样品准备

将采集来的蓝藻放入若干支50ml离心管内配平，放置在冰柜冷藏（2℃）保存备用。用抽滤机和布氏漏斗对蓝藻进行预处理。

1.3 标准样品配置

分别使用0.1mol/l的磷酸盐缓冲液和100%乙醇为提取剂，配置浓度为25、20、15和10g/l的蓝藻溶液，每组设两支试管，共16支试管，用P1至P8，Y1至Y8表示。

1.4 藻蓝蛋白的提取

反复冻融法：将装有配置好的藻蓝蛋白标准样品的离心管先放入液氮中冷冻20min，然后置于50℃水浴中加热20min，反复冻融3次后，经离心机以8000r/min离心20min。

1.5 藻蓝蛋白浓度的测定根据Bennet公式计算藻蓝蛋白浓度。

式中，藻蓝蛋白浓度Cpc的单位为mg/L；OD615、OD652分别是藻蓝蛋白提取液在615、652 nm处的吸光值。

2 结果与分析

2.1 不同方法提取的藻蓝蛋白浓度结果

表1 以0.1mol/l磷酸盐缓冲液为提取剂的蓝藻溶液的吸光值

表2 以100%乙醇为提取 剂的蓝藻溶液的吸光值

表3 以0.1mol/l磷酸盐缓冲液为提取剂的藻蓝蛋白浓度

表4 以100%乙醇为提取剂的藻蓝蛋白浓度

图1 不同冻融介质条件下藻蓝蛋白浓度

冻融完成后，用分光光度仪分别测出不同冻融介质条件下藻蓝蛋白溶液的在615、652 nm处的吸光度（表1和表2），之后通过Bennet公式计算得到藻蓝蛋白浓度（表3和表4）并将两组数据绘与一张图上（图1）。由图可得，除了第三组（P-3和Y-3）外，其余组中，用磷酸盐缓冲液作提取剂的藻蓝蛋白浓度均大于用乙醇作提取液的藻蓝蛋白浓度，且提取到的藻蓝蛋白浓度差距较大，说明磷酸盐缓冲液的提取藻蓝蛋白效果明显好于乙醇。

2.2 稀释比例的影响

图2 磷酸盐缓冲液稀释比例与藻蓝蛋白浓度关系

图3 100%乙醇稀释比例与藻蓝蛋白浓度关系

以10g/l的蓝藻溶液为标准液，分别用0.1mol/l的磷酸盐缓冲液和100%乙醇配制出稀释比例为0.4，0.5，0.67，1的蓝藻溶液。经过反复冻融法，得到藻蓝蛋白溶液，通过分光光度仪测出藻蓝蛋白浓度，绘出下图（图 2,和图 3）。

通过图2可以发现，以磷酸盐缓冲液为提取剂的蓝藻溶液，在稀释比例为1时，所得到的藻蓝蛋白浓度最高，在稀释比例为0.67时，得到藻蓝蛋白浓度最低。在稀释比例由0.4增加到0.67时，得到藻蓝蛋白浓度不断降低，在稀释比例为1倍时升高，可以推断，在0.67到1之间存在藻蓝蛋白浓度的最低点。

通过图3可以发现，以乙醇为提取剂的蓝藻溶液，在稀释比例为0.5时，所得到的藻蓝蛋白浓度最高。在稀释比例为0.4和0.67之间存在藻蓝蛋白浓度的最高点。当稀释比例由0.67增加到1时，得到藻蓝蛋白浓度降低。

3 讨论

在水体水华日益加剧的情况下，提取藻蓝蛋白溶液，实现藻蓝蛋白高附加值资源化的研究显得尤为重要，它本身就符合循环经济的理念。该试验选取宣城水体水华时新鲜蓝藻作为试验对象，利用藻蓝蛋白粗提液得率为评价指标，研究不同冻融介质、不同稀释比例对藻蓝蛋白提取效果的影响。

每种物质都有自身的特征吸收光谱，吸收峰波长可以对已知物质定性[4]。已有研究结果[5]表明，藻蓝蛋白吸收峰位于620 nm附近。反复冻融法、超声波法、溶胀法、丙酮法等方法的藻蓝蛋白提取液在620 nm附近具有吸收峰，而其中反复冻融法620 nm的峰高最强。由此可得反复冻融法的提取效果优于其他方法，因此本次实验采用冻融法提取蓝藻中的藻蓝蛋白。

已有研究结果表明[6]，随冻融次数的增加，得到藻蓝蛋白的纯度，得率均有所下降。本次实验通过反复冻融三次，用0.1mol/l的磷酸盐缓冲液和100%乙醇为提取剂，获得蓝藻中的藻蓝蛋白。实验结果表明，用0.1mol/l的磷酸盐缓冲液为提取剂所得到的藻蓝蛋白浓度远远大于用100%乙醇为提取剂得到的藻蓝蛋白。

可能是由于一定浓度的磷酸盐缓冲液最接近生物体的环境溶液，藻蓝蛋白在该环境中易于保存，而其他冻融介质不具备该特性。

本实验同时研究了磷酸盐缓冲液和乙醇的最适稀释比例。实验结果表明，以磷酸盐缓冲液为提取剂的蓝藻溶液，在稀释比例为0.67到1之间存在藻蓝蛋白得率的最低点。在稀释比例为1时，为藻蓝蛋白得率的最高点。以乙醇为提取剂的蓝藻溶液，最适稀释比例位于0.4和0.67之间。

[1]李辉东.太湖蓝藻藻蓝蛋白提取纯化工艺研究,南京理工大学,2012

[2]Bennett A，Bogorad L．Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga．Journal of Cell Biology，1973，58(2):419-435．

[3]庞晓宇.富营养化湖泊水体中藻蓝蛋白提取方法的对比:中国科学院南京地理与湖泊研究所湖泊与环境国家重点实验室，南京210008

[4]刘志广.分析化学.北京:高等教育出版社，2008:227-228．

[5]张允允，陈敏.蓝隐藻藻蓝蛋白的分离、纯化及性质研究．烟台大学学报:自然科学与工程版，2011，24(4):281-286．

[6]赵冰冰.不同冻融条件对破壁提取巢湖水华新鲜蓝藻中藻蓝蛋白的影响．安徽合肥:安徽农业科学，2014，42(17):5345-5347，5392