纤维素酶预处理对纤维素-Ag复合抗菌材料制备的影响

徐永建， 雷 凤， 徐 洋， 李莎莎

(陕西科技大学 轻工科学与工程学院 陕西省造纸技术及特种纸品开发重点实验室 轻化工程国家级实验教学示范中心， 陕西 西安 710021)

纤维素酶预处理对纤维素-Ag复合抗菌材料制备的影响

徐永建， 雷 凤， 徐 洋， 李莎莎

(陕西科技大学 轻工科学与工程学院 陕西省造纸技术及特种纸品开发重点实验室 轻化工程国家级实验教学示范中心， 陕西 西安 710021)

采用原位还原法，以竹浆纤维为基体，纤维素为还原剂，在纤维素纤维表面还原银离子得到纤维素-Ag复合抗菌材料.通过纤维素酶预处理提高纤维素的还原性，以期更多的Ag+被还原在纤维表面.使用偏振塞曼原子吸收光谱检测纤维素纤维中Ag含量，采用抑菌圈法评价复合材料的抗菌性能.结果表明：利用纤维素酶预处理对于提高纤维素的还原性有一定的效果，纤维素酶用量50 u/g，温度50 ℃，pH5左右时，纤维素还原银离子的效果最佳，纤维素-Ag复合抗菌材料纤维表面银负载量最高，抗菌性最优.

原位还原； 纤维素酶； 银负载量； 抗菌性

0 引言

纤维素是一种天然多羟基的生物大分子，具有优良的金属离子吸附特性，是自然界中最丰富的自然资源，广泛应用于纺织品及医疗卫生等与人体接触密切的产品中[1].纤维素本身不具有抗菌性，在应用纤维素产品时难免会产生细菌污染的问题，因此对纤维素进行抗菌改性是目前研究的热点[2,3].银及其化合物具有优异的抗菌性能，对650多种细菌都有很好的抗菌作用，因而可以作为良好的抗菌材料应用于抗菌领域[4].将银离子还原并负载于纤维素纤维表面，可以赋予纤维素优异的抗菌性能，使纤维素产品在使用过程中抑制细菌的大量生长繁殖，有利于减少人体受到外界细菌的侵害.

与普通的银相比，纳米银颗粒粒径较小，银原子趋向于粒子的外层，因此表现出一些优异的特性[5,6].近年来的研究与发展表明,纳米银粒子由于具有较大的比表面积和表面能、独特的电化学性能、光学性能、催化活性等优良特性而使其具有广谱抗菌性[7].若能将纳米银颗粒负载在纤维表面，则纤维素材料能够获得优异的抗菌性能[8-10].

纤维素大分子的两个末端基性质不同，在一端的葡萄糖基第一个碳原子上存在一个苷羟基，当葡萄糖环型结构变为开链式时，此苷羟基变为醛基而具有还原性[11].因此对于纤维素整个大分子来说，其具有一定的还原性，能还原Ag+并使其负载在纤维表面.但由于纤维素中末端还原基少，使得纤维素还原性较弱.因此，通过纤维素酶降解纤维素使其暴露出更多的末端还原基,使更多的Ag+被还原并负载在纤维表面.纤维素的结构式如图1所示.

图1 纤维素的结构式

纤维素酶是一种复合酶系，主要包括：(1)内切葡聚糖酶，也称Cx酶，其作用是随机地进攻无定形区纤维素的骨架，使β-1,4-糖苷键断裂，内切酶分子每切断一个β-1,4-糖苷键，就会在纤维素大分子链上产生一个新的潜在的醛基，该醛基是较活泼的还原性基团[12]；(2)外切葡聚糖酶，也称C1酶，该酶可以从纤维素糖链的还原端或非还原端逐步降解纤维素，释放出纤维二糖或葡萄糖；(3)β-葡萄糖苷酶，也称纤维二糖水解酶，其可以将纤维素内二糖或低分子的纤维糊精水解生成葡萄糖，纤维素酶降解纤维素的过程是以上三种酶的协同作用[13-15].图2为纤维素酶的作用机理.显然，纤维素经纤维素酶处理后，能够暴露出更多的末端还原基，有利于Ag+的原位还原.

图2 纤维素酶的作用机理

基于纤维素酶对于纤维素的降解作用可以提高其还原性，本论文采用原位还原法，以竹浆纤维为基体，纤维素为还原剂，在纤维素纤维表面还原银离子得到纤维素-Ag复合抗菌材料.并通过纤维素酶预处理提高纤维素的还原性，研究其对原位还原效果的影响.通过偏振赛曼原子吸收光谱法测定复合材料中的Ag含量，并使用抑菌圈法检测复合材料对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抗菌性能.

1 实验部分

1.1 主要原料

竹浆板，购于贵州赤天化纸业有限公司；纤维素酶，上海宝曼生物科技有限公司；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，南京便诊生物科技有限公司；硝酸银、硫酸、氢氧化钠，国药试剂有限公司.

1.2 主要仪器设备

电热恒温水浴锅，HH-2，北京科伟永兴仪器有限公司；pH计，pHS-3C，上海仪电科学仪器公司；纸样抄取器，ZQJ1-B-Ⅱ，陕西科技大学造纸机械厂；偏振塞曼原子吸收光谱，Z-2000，日本HITACHI公司；SEM，S4800，日本HITACHI公司.

1.3 实验方法

1.3.1 载纳米银纤维素纤维的制备

将竹浆板浸泡水中24 h，疏解，挤压，撕浆，平衡水分后置于塑封袋中备用.称取适量绝干浆，并加入稀硫酸或氢氧化钠调节pH，加入纤维素酶溶液，置于一定温度的水浴锅中反应一定时间，反应完成后高温使得纤维素酶失活，酶处理反应终止.

取适量纤维素酶处理过的浆料，加入0.1 mol/L AgNO3溶液一定量，放于特定温度的水浴锅中反应，完成后，将浆料取出，疏解，抄片，干燥保存备用.

1.3.2 纸浆还原性能的检测

测定纸浆的还原性能通常采用测定铜价[16]的方法.铜价是指100 g绝干纸浆纤维，在碱性介质中，于100 ℃时将硫酸铜还原为氧化亚铜的克数.

实验参照GB/T5400-1998纸浆铜价的测定方法进行.

1.3.3 纤维银负载量的检测

实验采用偏振塞曼原子吸收光谱仪检测银负载量.

首先配制银标准溶液，称取0.157 4 g硝酸银于烧杯中，加入去离子水适量，移入1 000 mL容量瓶中，定容，得到银负载量为100 mg/L的硝酸银溶液. 用移液管分别移取1 mL,2 mL,3 mL,4 mL此溶液于4个100 mL容量瓶中，定容至100 mL，得到银负载量分别为1 mg/L,2 mg/L,3 mg/L,4 mg/L的银标准溶液，纯蒸馏水作为空白样.采用AAS制作银离子标准曲线.

取0.1 g制备的复合材料于烧杯中，加入50～100 mL 50%硝酸，用电炉使其完全溶解，待冷却后，移入100 mL容量瓶中，定容.检测制备的复合材料中银负载量.注意配置好溶液后，过滤，保证溶液澄清.

1.3.4 纸浆抗菌性能的检测

参照GB/T 20944《纺织品抗菌性能的评价》中琼脂平皿扩散法和振荡法检测样品的抗菌性能.本实验采用琼脂平皿扩散法[17].

向无菌平皿中倾入10 mL高压灭菌后的营养琼脂培养基，待其凝固后，加入0.1 mL实验菌液，用玻璃棒涂布均匀，然后将制备的复合材料剪成直径为14 mm圆片并贴于培养基表面，在37 ℃下培养24 h并测定抑菌圈宽度.

2 结果与讨论

2.1 不同纤维素酶添加量处理效果评价

加入20 g绝干浆，pH为5，50 ℃下进行酶处理反应，完成后再加入4 mL，0.1 mol/L的AgNO3溶液,90 ℃下水浴1 h，纤维素酶添加量对纤维素还原性能和纤维上的银负载量的影响如图3所示.

图3 纤维素酶用量对铜价和银负载量的影响

图3表明，随着纤维素酶用量的增加，铜价和银负载量都随之增大.纤维素酶对纤维素有一定的切断作用，增加酶用量，纤维素暴露出更多的末端醛基，铜价增加；同时，更多的银离子被还原在纤维上，银负载量增加.

2.2 不同温度下酶处理效果评价

加入20 g绝干浆，pH为5，纤维素酶添加量50 u/g下进行酶处理反应，完成后再加入4 mL，0.1 mo/L AgNO3溶液,90 ℃下水浴1 h，温度对纤维素还原性能和纤维上的银负载量的影响如图4所示.

图4 温度与铜价和银负载量的关系

图4表明，随着温度的升高，铜价和银负载量先增高后降低，温度为50 ℃左右时两者都达到最大值.原因是纤维素酶的最适反应温度为45 ℃～50 ℃，此时酶活力最大，酶对纤维素的切断作用最强裂，纤维素暴露出最多的末端醛基，表现出最强的还原性，铜价最高；同时，最多的银离子被还原在纤维上，银负载量最多.

2.3 不同pH下酶处理效果评价

加入20 g绝干浆，温度为50 ℃，纤维素酶添加量50 u/g下进行酶处理反应，完成后再加4 mL，0.1 mol/L AgNO3溶液，90 ℃下水浴1 h，pH对纤维素还原性能和纤维上的银负载量的影响如图5所示.

图5 pH与铜价和银负载量的关系

图5表明，随着pH增大，铜价和银负载量先增加后减小，pH在5左右时，铜价和银负载量最大，原因是纤维素酶的最适pH一般为4.5～5.5，此时酶活力最大，酶对纤维素的切断作用最强裂，纤维素暴露出最多的末端醛基，表现出最强的还原性，铜价最高；同时，最多的银离子被还原在纤维上，银负载量最多.

2.4 纤维形貌学表征

原料纤维和复合材料的表面形貌差别很大，如图6(a)、(b)所示.原料纤维(图6(a))表面光滑，微细纤维趋向明显，无颗粒状的物质；复合材料(图6(b))微细纤维趋向减弱，纤维表面被破坏，有大小形状不一的白色晶体.由复合材料的能谱分析结果(图6(c)、表1)可发现，C和O是复合材料的主要组成元素，此外还有Ag元素的存在，说明Ag+被还原在纤维上，达到了预期效果.

(a)原料纤维的SEM图

(b)复合材料的SEM图

(c)复合材料的能谱图

元素质量百分数/Wt%原子百分数/At%C43．3050．67O56．0749．25Ag00．6400．08

2.5 抗菌效力表征

采用抑菌圈法评价复合材料的抗菌性能，本研究选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为实验细菌.复合材料对于这两种细菌的抗菌效果见图7所示.

图7表明，空白样无抑菌圈，而复合材料有明显的抑菌圈，说明复合材料对革兰氏阴性、阳性细菌都有优异的抗菌性能，这与预期的效果一致.而且复合材料在金黄色葡萄球菌培养基上产生的抑菌圈大于在大肠杆菌培养基上产生的抑菌圈，说明复合材料对于金黄色葡萄球菌的抑菌效果强于对于大肠杆菌的抑菌效果.

(a)A1 、A2、A3对大肠杆菌的抗菌效果图 (b)A4、A5对大肠杆菌的抗菌效果图

(c)A1、A3对金黄色葡萄球菌的抗菌效果图 (d)A2、A4、A5对金黄色葡萄球菌的抗菌效果图

3 结论

(1)纤维素酶预处理纤维素是一种操作简单，比较合理的提高其还原性的方法.

(2)负载银的纤维具有优异的抗菌性.

(3)当纤维素酶添加量为50 u/g，温度为50 ℃，pH为5时，纤维素酶的活力最大，此时使得纤维素暴露出来的还原性基团最多，还原在纤维上银离子的含量最多，取得最优异的抗菌效果.

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[17] GB/T 20944.1-2007，纺织品抗菌性能的评价:第1部分琼脂平皿扩散法[S].

【责任编辑：蒋亚儒】

Effectofcellulasepretreatmentonpreparationofcellulose-Agantibacterialcompositematerials

XU Yong-jian， LEI Feng， XU Yang， LI Sha-sha

(College of Bioresources Chemical and Materials Engineering， Shaanxi Province Key Laboratory of Papermaking Technology and Specialty Paper， National Demonstration Center for Experimental Light Chemistry Engineering Education， Shaanxi University of Science amp; Technology, Xi′an 710021， China)

Cellulose-Ag composites were obtained by reducing Ag+on the surface of cellulose with in-situ method. Cellulase was used to improve the reducibility of cellulose which was important for the amount of reduced Ag on the surface of fiber.Polarized Zeeman atomic absorption spectrum was used to detect Ag amount of composites.The anti-bacterial properties of composite materials were evaluated by inhibition zone method.Result shown that,cellulase was benefit for the elevation of cellulose reducibility.The optimum conditions of cellulase per-treatment were 50 u/g cellulase addition,50 ℃,pH=5.Moreover,the anti-bacterial properties of composite were increasing with the augment of Ag amount.

in-situ reduce; cellulase; silver loading; antibacterial activity

2017-08-27

国家自然科学基金项目(31170559); 华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室开放基金项目(202101704); 陕西科技大学学科学术团队培育计划项目(2013SXD25)

徐永建(1970-)，男，陕西西安人，教授，博士生导师，研究方向：植物纤维资源高值化利用、清洁生产及碱回收除硅技术

2096-398X(2017)06-0015-05

TS721

A