用酶联免疫吸附法测定畜产品、饲料中β-兴奋剂类药物

孙作刚，赵晓凤

（新疆兽药饲料监察所，新疆乌鲁木齐830063）

用酶联免疫吸附法测定畜产品、饲料中β-兴奋剂类药物

孙作刚，赵晓凤

（新疆兽药饲料监察所，新疆乌鲁木齐830063）

本实验采用酶联免疫吸附法测定β-兴奋剂类药物，在添加浓度为0.5 μg/L，1.0 μg/L的空白尿液中的回收率均在88.6%～110.3%之间；在添加浓度25 μg/kg，50 μg/kg的空白猪配合饲料中的回收率均在83.1%～106.2%之间；在添加浓度为0.5 μg/kg，1.0 μg/kg的空白羊肉中的回收率均在73.6%～106.3%之间；在添加浓度为0.5 μg/kg，1.5 μg/kg的空白牛肉中的回收率在76.5%～106.5%之间。各添加浓度的批内、批间变异系数均小于11%，满足残留检测方法回收率在60%～120%；批内、批间变异系数小于等于20%的要求。结论：用酶联免疫吸附法可对畜产品、饲料中β-兴奋剂类药物残留进行初步筛选，对疑似阳性样品再用仪器方法确认。

β-兴奋剂类药物；畜产品；饲料；酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种敏感性高，特异性强，重复性好的快速检测方法。β-兴奋剂类药物（肾上腺素受体激动药adrenoceptor agonists，简称BAA）是一类与肾上腺素受体结合，激动受体，产生肾上腺素样的作用的药物的总称。基本化学结构为β–苯乙胺，一般可分为含取代基的苯胺型（如克伦特罗）、苯酚型（如沙丁胺醇）、苯二酚型（如特布他林）等三大类。按其受体不同，又可分为六类，能与β受体结合的肾上腺素受体激动药被称为β肾上腺素激动药，此类药物作用于平滑肌后，会使心肌收缩力加强、兴奋性增高，习惯又叫做β-受体激动剂[1]。许多生产者采用BAA作为饲料添加剂来提高瘦肉率和改善胴体品质[6][7]。当人体中累计摄入剂量超过一定值或一次食入高残留量（＞100 ng/g）的内脏组织如肝、肾、肺时易出现BAA的毒副作用[8][9]。人、畜中毒症状相似，主要有骨骼肌收缩增加，肌肉震颤，四肢和面部肌肉最明显，轻者感觉不适，重者出现行走不稳。严重者还可危及生命。目前对BAA类药物残留检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、气/质联用分析法（GC/MS）、放射免疫分析法（IA）、气相色谱法（GC）、高效薄层色谱法（HTLC）[3～5]、液/质联用分析法（LC/MS）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）和放射受体分析法等[2]。在所有的检测分析方法中，酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种敏感性高、特异性强、重复性好的快速检测方法[10][11]。它能在短短的几个小时检测几十到上百个试样，适合于对药物残留的初步筛选。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1试剂盒

勤邦生物技术有限公司β-兴奋剂类残留检测试剂盒（以下简称勤邦试剂盒）包括：96孔酶联板，系列标准溶液（浓度分别为0、0.1、0.4、1.6、6.4、25.6 μg/L），浓缩酶结合物，酶结合物稀释液，浓缩洗涤液，底物A、B液，终止液，浓缩复溶液。

1.1.2 仪器

Waters液相色谱/质谱/质谱联用仪、微孔板酶标仪（配备450nm滤光片）、涡旋仪、匀质器、振荡器、天平：感量0.01 g、离心机、微量移液器：单道20～200 μL、200～1 000 μL，多道250 μL、氮吹仪。

1.1.3 试剂

三氯乙酸、无水碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、乙醇。

1.1.4 标准溶液制备

精密称取一定量的克仑特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、克仑潘特、溴布特罗、溴氯布特罗、马喷特罗、马布特罗、特布他林标准品（标准品品牌Sigma），用甲醇配制为溶液1 μg/mL的标准储备液。

1.1.5 溶液

1.1.5.1 2.5%三氯乙酸溶液：称取12.5 g三氯乙酸加入500 mL去离子水溶解混匀。

1.1.5.2 组织样本稀释液：称取0.64 g无水碳酸钠、1.184 g碳酸氢钠和40 g氯化钠加入500 mL去离子水溶解混匀。

1.1.5.3 饲料样本稀释液：称取40 g氯化钠加入500 mL去离子水溶解混匀。

1.2 样品处理方法

1.2.1 试样的制备

1.2.1.1 取适量试料（牛肉、羊肉）10 000 r/min匀浆1 min、取适量饲料10 000 r/min，磨碎。

1.2.1.2 取绞碎后的空白牛肉、羊肉，空白尿液和空白饲料作为空白测试样品，所有空白样品均经过液质方法确证过。

1.2.2 样本前处理

按照试剂盒说明书上尿液、牛肉、羊肉、饲料样品的样本前处理方法进行操作。

1.2.3 检测

样品经处理后按勤邦试剂盒说明书上步骤进行检测。仪器法按《饲料中8种β-受体激动剂残留检测气相色谱-质谱法》（农业部1063号公告-7-2008）和《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液相色谱色谱-串联质谱法》（农业部1025号公告-18-2008）步骤进行检测。

2 结果

2.1 试剂盒灵敏度复核

2.1.1 按50%抑制法评价

标准曲线0浓度标准溶液吸光度值50%处所对应的药物浓度，即IC50，来评价试剂盒的检测限。做标准曲线5条，运用相应软件计算出每条曲线的IC50值，得到5个50%抑制浓度，见表1。

表1 IC50计算结果μg/L（kg）

由表1可知，试剂盒IC50平均值为0.67 μg/L。

2.1.2 按最低检测限评价

样品的最低检测限也是灵敏度的评价指标。分别测定尿液、牛肉、羊肉、饲料各20份空白样本，求出空白样品的平均值，在加上三倍标准差，即为最低检测限。如此考察本检测方法在尿液、牛肉、羊肉、底料中β-兴奋剂类药物的最低检测限，空白尿液、牛肉、羊肉、饲料的测定结果分别见表2至表5。

表2 尿液样本的最低检测限μg/L

由表2可知，尿液的最低检测限为0.32 μg/L。

表3 牛肉样本的最低检测限μg/kg

由表3可知，牛肉的最低检测限为0.53 μg/L。

表4 羊肉样本的最低检测限μg/kg

由表4可知，羊肉的最低检测限为0.55 μg/L。

表5 饲料样本的最低检测限μg/kg

由表5可知，饲料的最低检测限为5.32 μg/L。

2.2 试剂盒的准确度和精密度

准确度是指测得值与真实值的符合程度，在ELISA测定中，准确度常以回收率表示，精密度常以变异系数来表示。在空白尿液中，将克仑特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、克仑潘特、溴布特罗、溴氯布特罗、马喷特罗、马布特罗、特布他林分别添加至浓度为0.5 μg/L、1.0 μg/L；在空白饲料中，将克仑特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、克仑潘特、溴布特罗、溴氯布特罗、马喷特罗、马布特罗、特布他林分别添加至浓度为25 μg/kg、50 μg/kg；在空白牛肉、空白羊肉中，将克仑特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、克仑潘特、溴布特罗、溴氯布特罗、马喷特罗、马布特罗、特布他林分别添加至浓度为0.5 μg/kg、1.0 μg/kg。每种样品，每个浓度各4个平行测定3批。计算平均值、添加回收率及批内批间变异系数。结果见表6、表7。

表6 尿液、饲料样品添加平均回收率和变异系数（N=4）

表7 牛肉、羊肉样品添加平均回收率和变异系数（N=4）

从表6、表7可知，测定三批试剂盒，每批试剂盒测定结果取均值计算显示，克仑特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、克仑潘特、溴布特罗、溴氯布特罗、马喷特罗、马布特罗、特布他林在添加浓度为0.5 μg/L，1.0 μg/L的空白尿液中的回收率均在88.6%～110.3%之间；在添加浓度25 μg/kg，50 μg/kg的空白猪配合饲料中的回收率均在83.1%～106.2%之间；在添加浓度为0.5 μg/kg，1.0 μg/kg的空白羊肉中的回收率均在73.6%～106.3%之间；在添加浓度为0.5 μg/kg，1.5 μg/kg的空白牛肉中的回收率均在76.5%～106.5%之间；各添加浓度的批内、批间变异系数均低于11%。

2.3 与仪器方法对比试验

用研制的试剂盒和仪器方法（动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液相色谱色谱-串联质谱法农业部1025号公告-18-2008）分别测定了从市场上抽取的羊肉、牛肉样品共20份样品，勤邦试剂盒羊肉、牛肉最低检测限为：0.5 μg/kg；液相色谱色谱-串联质谱法克仑特罗定量限为：0.5 μg/kg；沙丁胺醇定量限为：0.5 μg/kg；结果如表8。

由于多残留检测试剂盒可同时检测样本中10种兴奋剂残留量，样本03号试剂盒克仑特罗检测结果高于仪器方法较多，推测可能样本中有其他兴奋剂药物残留。与仪器方法相比较，试剂盒的准确度与仪器检测结果符合，阴阳性样本符合率100%。

表8 试剂盒和仪器方法对比实验

3 讨论

对于BAA类药物残留检测来说，虽然高效液相色谱法、GC/MS和LC/MS/MS法等这些仪器方法具有精确可靠、灵敏度高、重复性好以及假阳性少等优点，但需要昂贵的仪器设备，单位时间内能处理样品的能力有限。目前，最通用的BAA类药物残留检测方法是用ELISA对样品进行初筛，再对阳性样品用GC/MS或LC/MS/MS进行进一步验证。

本实验用酶联免疫吸附法测定克仑特罗、沙丁胺醇、塞布特罗、妥布特罗、克仑潘特、溴布特罗、溴氯布特罗、马喷特罗、马布特罗、特布他林在添加浓度为0.5 μg/L，1.0 μg/L的空白尿液中的回收率均在88.6%～110.3%之间；在添加浓度25 μg/kg，50 μg/kg的空白猪配合饲料中的回收率均在83.1%～106.2%之间；在添加浓度为0.5 μg/kg，1.0 μg/kg的空白羊肉中的回收率均在73.6%～106.3%之间；在添加浓度为0.5 μg/kg，1.5 μg/kg的空白牛肉中的回收率均在76.5%～106.5%之间；各添加浓度的批内、批间变异系数均小于11%，满足残留检测方法回收率在60%～120%；批内、批间变异系数小于等于20%的要求。

通过试剂盒与仪器方法的对比复核，ELISA检测样本与仪器方法检测结果符合。用酶联免疫吸附法对大批量畜产品、饲料中β-兴奋剂类药物残留进行初步筛选[A5]，对疑似阳性样品再用仪器法确认，可节约大量时间和成本。

[1] 王若军.Beta-肾上腺素能兴奋剂的作用机理及应用效果[J].国外畜牧科技，1994，21（2）：32-34.

[2] 李俊锁.兽药残留分析[M].上海：上海科技出版社，2002.

[3] 戴华，袁智能，黄志强.饲料中盐酸克伦特罗、沙丁胺醇高效液相色谱测定[J].分析测试学报，2003，22（3）：57-60.

[4]Shen S H，Jin O Y，Willy R G B.Determination ofβ2-agonists by ion chromatography with directconductivity detection[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2005，（38）：166-172.

[5] Zhou T S，Hu Q，Yu H.Separation and determination ofβ-agonists in serum by capillary zoneelectrophoresis with amperometric detection[J].Analytica Chimica Acta，2001，（441）：23-28.

[6] 何庆兰.β-肾上腺素能受体兴奋剂（BAA）在养猪中的应用[J].浙江畜牧兽医，1995，（4）：20-21.

[7] 曾占宏.完美的饲料复合添加剂及影响因素[J].国外畜牧学（猪与禽），1997，（6）：16-21.

[8] 屈健.β—兴奋剂在动物饲养中的负效应[J].饲料与畜牧，1998，（5）：27-28.

[9] 刘宣兵，庞玉芳，侯玉泽，等.沙丁胺醇的毒副作用及其残留检测[J].上海畜牧兽医通讯，2008,（04）:83-85.

[10] 郑红.猪肉组织中β_2-受体激动剂残留检测方法研究[D].济南：山东大学，2011.

[11] 汪慧蓉.β-兴奋剂克伦特罗、沙丁胺醇的免疫检测方法研究[D].西安：西北大学，2006.

Beta-stimulant Drugs in Animal Products and Feed Were Determined by Enzyme-linked Immunosorbent Assay

SUN Zuo-gang，ZHAO Xiao-feng
（Xinjiang Veterinary and Feed Supervision Institute,Urumqi 830063，China）

In this experiment,the enzyme linked immunosorption method was used to determine the betastimulant drug,and the recovery rate in the blank urine of 0.5 μg/L and 1.0 μg/L was between 88.6%and 110.3%.In add concentration（including 25 μg/kg,including 50 μg/kg of blank pig feed the recoveries are between 83.1%and 106.2%;The recovery rate of the blank mutton with the concentration of 0.5 μg/kg and 1.0 μg/kg was between 73.6%and 106.3%.The recovery rate in the blank beef with a concentration of 0.5 μg/kg and 1.5 g/kg was between 76.5%～106.5%.The variation coefficient of each addition concentration was less than 11%,and the recovery rate oshijihef the residual detection method was 60%～120%.The variation coefficient of the batch and batch is less than or equal to 20%.Conclusion:enzyme-linked immunosorbent assay can be used for preliminary screening of drug residues in animal products and feedstuffs,and can be confirmed by means of instrument for suspected positive samples.

beta-stimulant drugs;Animal products;feed;enzyme-linked immunosorbent assay

S854.4

A

1003-6377（2017）06-0031-07

孙作刚（1969-），男，大学本科，兽医师，长期从事兽药饲料监察工作。E-mail：1428216280@qq.com

2017-09-03，

2017-09-20

10.16863/j.cnki.1003-6377.2017.06.007