替加环素对肺炎克雷伯菌的防耐药突变浓度研究

钟 雪，陈东科， 许宏涛， 冯婉玉

替加环素对肺炎克雷伯菌的防耐药突变浓度研究

钟 雪1，陈东科2， 许宏涛2， 冯婉玉1

目的考察替加环素对肺炎克雷伯菌的潜在耐药性。方法测定替加环素对于药敏背景不同的肺炎克雷伯菌防突变浓度（MPC）和最低抑菌浓度（MIC）。比较MIC与MPC之间的相关性，考察是否能用MIC推测MPC值。结合MPC和防耐药突变窗（MSW）与替加环素药动学参数评估替加环素单药治疗对于肺炎克雷伯菌的潜在耐药性。结果碳青霉烯类耐药、喹诺酮类耐药组肺炎克雷伯菌对替加环素的MPC较碳青霉烯类敏感、喹诺酮类敏感组高出8倍。替加环素对于肺炎克雷伯菌的MPC范围在4～512 mg/L，MPC90为64 mg/L，远高于替加环素血药浓度。结论替加环素长期单药治疗对于肺炎克雷伯菌的潜在耐药率较高，不宜单独使用，提示临床应加强监测替加环素菌株敏感性及替加环素疗效。

替加环素； 肺炎克雷伯菌； 防耐药突变浓度

近年来耐药肺炎克雷伯菌的检出率逐年增高，产ESBL和AmpC酶及碳青霉烯酶（KPC-2酶）肺炎克雷伯菌的抗生素选择已成为抗感染治疗面临的严峻挑战。替加环素作为新型甘氨酰环素类抗菌药物在临床抗多药耐药菌感染的治疗中发挥了重要作用。但是近年来全世界范围内陆续检出对替加环素耐药的菌株，国外文献多个案例报道显示长期单药治疗是产生替加环素耐药的高危因素[1-11]。自2007年以来陆续有文献报道在使用替加环素治疗鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌感染过程中产生耐药[1，8-9，12]，究其原因可能与替加环素相对较高的防耐药突变浓度（mutant prevention concentration，MPC）有关。Zhao等[13]首先提出了MPC和细菌突变选择窗（mutant selection window， MSW）理论。优选药物浓度既高于MIC，又高于MPC 的药物才能达到既能杀灭细菌，又能防止细菌耐药的治疗效果。但当某种抗菌药物对某类细菌的MPC过高时，药物浓度落入MSW时间越长，越易引起耐药突变株选择性富集扩增。例如Cui等[14]研究替加环素对于鲍曼不动杆菌的MPC，从而评估替加环素是否易对鲍曼不动杆菌存在潜在耐药性，他们得到结论为：替加环素对鲍曼不动杆菌MSW较宽，从而使替加环素浓度落在MSW时间长，耐药突变株很易选择性富集扩增，最终导致鲍曼不动杆菌对替加环素耐药。但是每种抗菌药物对不同的致病菌其MSW都是不同的。替加环素针对肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌的MPC尚未见报到，有待进一步研究考察替加环素对其他种属细菌的潜在耐药性。

1 材料与方法

1.1 菌株及试剂来源

收集北京医院临床分离的肺炎克雷伯菌共91 株。大肠埃希菌 ATCC 25922，金黄色葡萄球菌 ATCC 29213，肺炎克雷伯菌 ATCC BAA-2146作为药物敏感性试验的质控菌株。MH培养基、MH肉汤培养基（OXOID公司），替加环素（辉瑞制药有限公司），亚胺培南、美罗培南、厄他培南、环丙沙星、左氧氟沙星（均产自中国药品生物制品检定所）。E试验条（法国生物梅里埃公司）。

1.2 肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类、喹诺酮类和替加环素的药敏试验

药敏试验采用标准琼脂平皿二倍稀释法[15]，用倍比稀释法配制环丙沙星、左氧氟沙星、美罗培南、亚胺培南、厄他培南和替加环素平皿。使用多点接种仪将细菌接种于各浓度的含药MH琼脂培养平皿上，将所有接种菌液的含药MH琼脂平皿置于35 ℃孵育16～24 h后观察结果，定义琼脂平皿上无菌生长的MIC值。替加环素药敏试验中质控菌株质控范围为金黄色葡萄球菌ATCC 29213，0.03～0.25 mg/L；大肠埃希菌ATCC 25922，0.03～0.25 mg/L；参考美国FDA的MIC折点来判断替加环素的结果，替加环素敏感（S）：≤2 mg/L，中介（I）：4 mg/L，耐药（R）：≥8 mg/L[15]。根据菌株对碳青霉烯类和喹诺酮类药物的敏感性不同，将细菌分为4组，分别记录4组中菌株对替加环素的MIC。其中显示对替加环素耐药的菌株采用微量肉汤稀释法及E试验法[15]再次确认耐药性。

1.3 替加环素对肺炎克雷伯菌的MPC测定

在报道过的文献基础上加以改良琼脂平皿稀释方法测定4组耐药背景不同肺炎克雷伯菌对替加环素的MPC[16]。根据测定替加环素对各菌株的MIC值大小，将相同或相近MIC值的菌株分组，以各菌株的MIC为基准，倍比递增替加环素的药物浓度，制备7个浓度梯度的含药琼脂平皿。将终浓度为3×1010cfu/mL的菌液各取0.1 mL分别涂布到一系列含不同浓度替加环素的培养皿上，每个药物浓度用4个平皿，使每个药物浓度培养平皿的细菌接种总量为1.2×1010cfu/mL。孵育观察结果：将所有涂布菌液的培养平皿放于35 ℃温室孵育，分别于24 h、48 h、72 h后观察各培养平皿中肺炎克雷伯菌的生长情况，孵育72 h后仍无细菌生长的最小浓度即为暂定的防变异浓度（provisional MPC，MPCpr）， 再以MPCpr为基准，线性增减20%药物浓度配制含药琼脂平皿，重复上述4步操作，以72 h后不出现细菌生长的最低药物浓度为MPC。MPC值被定义为能完全抑制肺炎克雷伯菌在平皿上生长的最低浓度。从最接近MPC浓度的含药平皿上筛选单克隆菌株，接种于不含药平皿上，传代2次后再接种于原筛选浓度的含药培养平皿上，若菌株仍能生长则为耐药突变株。

1.4 MIC与MPC相关性分析

使用SPSS18.0软件计算测定的MIC与MPC值之间的相关性。分组比较不同耐药背景下菌株MIC值和MPC值的区别。从而判断能否由MIC值推测MPC值。

2 结果

2.1 肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类和喹诺酮类的敏感性试验

根据6种抗菌药物对91株肺炎克雷伯菌的MIC值大小，判断细菌对碳青霉烯类药物和喹诺酮类药物的敏感性，当细菌对3种碳青霉烯类药物中的某1种耐药时则判断该细菌为碳青霉烯类耐药菌；当细菌对2种喹诺酮类药物中的1种耐药时则判断该细菌为喹诺酮类耐药菌。根据对两大类药物的耐药情况将菌株分为4组，分别为：①碳青霉烯类耐药，喹诺酮类耐药的肺炎克雷伯菌32株；②碳青霉烯类耐药，喹诺酮类敏感的肺炎克雷伯菌8株；③碳青霉烯类敏感，喹诺酮类耐药的肺炎克雷伯菌22株；④碳青霉烯类敏感，喹诺酮类敏感的肺炎克雷伯菌29株。同时将91株细菌根据对替加环素的敏感性不同分为替加环素耐药和敏感2组。以8 mg/L为替加环素的耐药折点，共获得对替加环素耐药的肺炎克雷伯菌13株，耐药率为14.3%（13/91）。

2.2 替加环素对肺炎克雷伯菌的 MIC和MPC结果

替加环素对91株肺炎克雷伯菌的MIC 和MPC值分布情况见图1，可以看出替加环素对肺炎克雷伯菌的MIC范围为0.25～32 mg/L，多数集中在1 mg/L；MPC范围为4～512 mg/L，多数集中在16 mg/L。各组不同耐药背景菌株MIC90、MPC90和MIC、MPC范围见表1。替加环素对91株肺炎克雷伯菌的MPC高于敏感折点（2 mg/L）2～256倍，见表2。其中替加环素耐药组的细菌MPC90高于敏感组8倍。碳青霉烯类和喹诺酮类双耐药组MPC90值高于碳青霉烯类和喹诺酮类双敏感组8倍。然而，碳青霉烯类耐药和喹诺酮类敏感组与碳青霉烯类敏感和喹诺酮类耐药组之间MPC90值无明显差别。

图1 最低抑菌浓度和防耐药突变浓度的分布Figure 1 Distribution of minimum inhibitory concentrations and mutant prevention concentrations of tigecycline against K. pneumoniae

表1 比较4种不同耐药背景的肺炎克雷伯菌突变前后的最低抑菌浓度和防耐药突变浓度Table 1 Minimum inhibitory concentrations before and after mutation and mutant prevention concentrations of tigecycline against K.pneumoniae isolates with four different resistance profiles（mg/L）

2.3 MIC与MPC相关性分析

表2中比较了不同MIC情况下MPC值的大小分布，由此可以看出当菌株间MIC 值相同时，MPC值分布并不相同。如MIC为2 mg/L的肺炎克雷伯菌有18株，然而其MPC值分别为4 mg/L（2株），8 mg/L（3株），16 mg/L（8株），32 mg/L（3株），64 mg/L（1株），128 mg/L（1株），共跨越6个2倍稀释数。使用SPSS计算MIC和MPC相关性，得到91株肺炎克雷伯菌（r2=0.53），13株替加环素耐药的肺炎克雷伯菌（r2=0.32），78株替加环素敏感的肺炎克雷伯菌 （r2=0.29）。

表2 替加环素对91株临床分离的肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度和防耐药突变浓度分布Table 2 The distribution of minimum inhibitory concentration and mutant prevention concentration of tigecycline for 91 clinical isolates of K. pneumoniae

3 讨论

MPC是防止细菌耐药突变株选择性富集扩增所需的最低抗菌药物浓度。MIC与MPC间的浓度范围定义为MSW，药物落入MSW内时，耐药突变株可被选择性富集扩增，MPC值越高或MSW越宽，细菌耐药突变株越容易选择性富集扩增。每种抗菌药物对不同的致病菌其MPC均不同，本研究通过测定替加环素对肺炎克雷伯菌的MPC，并且将MPC值与替加环素的Cmax值比较，从而评估替加环素单药治疗条件下的潜在耐药性。通过91株肺炎克雷伯菌进行MIC和MPC测定，肺炎克雷伯菌对替加环素的耐药率已达14.3%，替加环素仅上市数年时间，耐药菌株已逐渐被检出，值得临床关注。通过对其潜在耐药性的研究，从而根据药物特点制定合理的给药方案，可达到保证药物的使用寿命，延缓耐药进展。

因为MPC值的测定方法相对比较复杂，我们试图找到MIC值与MPC值的关联性，从而通过测定MIC值来推算MPC值的大小。通过对替加环素MIC和MPC 相关性的分析，本研究的数据显示两者相关性较差，这与之前报道是一致的[17]。说明不能简单通过MIC值来推测MPC值的大小。

此外，体外试验的MPC值可与体内试验的药动学参数Cmax进行比较，评估替加环素对于肺炎克雷伯菌的潜在耐药性。当MPC值大于Cmax说明替加环素对肺炎克雷伯菌的潜在耐药性大；当MPC值小于Cmax则相反。Conte等[18]的研究显示每12小时静脉注射替加环素50 mg后，其在血液中的浓度和细胞内液中的浓度分别为（0.38±0.06 ）mg/L和（15.2±7.6）mg/L。这是由于替加环素在组织中分布浓度较高，其血浆分布容积7～10 L/ kg，在骨组织、脾组织、肾组织中浓度为血浆中8倍，而在皮肤组织及肺组织中浓度为血浆中的3倍。本研究数据显示碳青霉烯类耐药和喹诺酮类耐药组替加环素对肺炎克雷伯菌的MPC90值为128 mg/ L，碳青霉烯类敏感和喹诺酮类敏感组替加环素对肺炎克雷伯菌的MPC90值为32 mg/L。而已发表的[18-20]有关替加环素不同给药剂量下体液或各组织中药物浓度显示替加环素说明书中推荐的常规剂量 （首剂100 mg，后每12 小时给药50 mg），给药达稳态后，血浆中替加环素的Cmax仅有（0.38±0.06） mg/L，在肺泡细胞内达最大浓度时也仅有（15.2±7.6） mg/L。替加环素对肺炎克雷伯菌的MPC值远高于其在血液中及肺组织中的药物浓度。说明肺炎克雷伯菌对替加环素的潜在耐药性很大，因此，在推荐的剂量下，替加环素的浓度很容易落在MSW内，很可能导致耐药突变株的富集扩增。提示目前临床使用的替加环素剂量在长期使用过程中会导致细菌产生耐药突变。

但随着给药剂量的增加，在某些部位替加环素的最大浓度可超过MPC值，说明不能单凭血药浓度来推测药物在感染部位的浓度，这是由替加环素独特的药动学特征决定的，因为组织药物浓度高，用血药浓度反映实际感染部位的药物浓度不适宜。也可以说感染部位的浓度比血药浓度能给临床提供更多的信息参考。加大给药剂量后在感染部位实际药物浓度可能超过健康受试者中得到的数据。本研究在某种程度上证明对于医院获得性肺炎（HAP）、呼吸机相关性肺炎（VAP），替加环素现有说明书中的给药剂量不足，需要增加给药剂量。

同时对于MPC值较高，MSW窗较宽的药物，除了增加药物剂量外，联合用药也不失为一种有效手段。不同作用部位的药物联合使用可以提供一种关闭MSW的途径，即使联合的药物各自都具有较高的MPC值。联合治疗的关键是选择药动图完全同步的两种药物联合，这样既能达到治疗的目的，又不至于出现耐药突变选择。适宜与替加环素联合的药物有待进一步研究考察。

本研究有一定的不足，首先收集的菌株来源单一，增加研究结果的偏倚，其次Choi等[21]发现外排泵的上调与替加环素的耐药相关，我们下一步计划针对外排泵进行深入研究。

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Research on the mutant prevention concentration of tigecycline for Klebsiella pneumoniae

ZHONG Xue, CHEN Dongke, XU Hongtao, FENG Wanyu.
（Department of Pharmacy, Peking University People's Hospital, Beijing100044, China）

ObjectiveTo investigate the potential tigecycline resistance ofKlebsiella pneumoniaeduring treatment.MethodsThe minimum inhibitory concentrations (MICs) and the mutant prevention concentrations (MPCs) of tigecycline were determined forK. pneumoniaeisolates with four different resistant profiles. Correlations between MICs and MPCs were analyzed.We combined with the pharmacokinetic parameters of tigecycline to estimate the potential of emerging resistance to tigecycline monotherapy inK. pneumoniae.ResultsThe MPCs of tigecycline for the carbapenem- and fluoroquinolone-resistant isolates were found to be 8-fold higher than those for carbapenem- and quinolones-susceptible isolates. Our data showed that the MPCs range and MPC90values of tigecycline were 4-512 mg/L and 64 mg/L, respectively, which were much higher than the therapeutic concentrations of tigecycline in serum and tissues. Conclusions Long-term tigecycline monotherapy may predispose the emergence of resistance inK. pneumoniae, which is not recommended. It is desirable to carry out ongoing monitoring ofK. pneumoniaesusceptibility and tigecycline treatment effect.

tigecycline;Klebsiella pneumoniae; mutant prevention concentration

R978.1

A

1009-7708 ( 2017 ) 06-0643-05

10.16718/j.1009-7708.2017.06.006

1. 北京大学人民医院药剂科，北京 100044；2. 北京医院检验科。

钟雪（1988—），女，博士研究生，主管药师，主要从事抗感染与慢病管理。

冯婉玉，E-mail：renminyaojike@sina.com。

2017-04-26 修回日期：2017-05-25