NaN3诱变处理对苜蓿愈伤组织抗旱及盐生理的响应

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(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院， 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

NaN3诱变处理对苜蓿愈伤组织抗旱及盐生理的响应

李波，马赫

(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院， 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

采用植物组织培养和叠氮化钠(NaN3)诱变方法，对2种苜蓿愈伤组织进行诱变和NaCl、PEG、混合胁迫处理，测定NaN3诱变对苜蓿愈伤组织5项生理指标的变化。结果表明：随着NaN3诱变和胁迫处理浓度的增加，苜蓿愈伤组织的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量均呈上升的趋势，电导率和丙二醛含量呈下降的趋势，NaN3诱变+混合胁迫处理可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量积累最多，电导率和丙二醛含量最少。

紫花苜蓿； 愈伤组织； NaN3； 旱和盐胁迫； 生理指标

表1 胁迫和诱变处理苜蓿愈伤组织的材料编号

编号龙牧801编号图牧2号A1对照A2对照B1PEG(LC50)B2PEG(LC50)C1NaCl(LC50)C2NaCl(LC50)D1NaN3(LC50)D2NaN3(LC50)E1NaN3(LC50+PEG(LC100)E2NaN3(LC50+PEG(LC100)F1NaN3(LC50+NaCl(LC100)F2NaN3(LC50+NaCl(LC100)G1NaN3(LC50+NaCl(LC100)+PEG(LC100)G2NaN3(LC50+NaCl(LC100)+PEG(LC100)

注：LC50为各浓度的半致死浓度；LC100为各浓度的致死浓度。

紫花苜蓿是豆科多年生草本植物，耐寒、耐旱且适应性强，草质优良，含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素等营养元素，广泛种植作为饲料与牧草,然而高盐和干旱等自然因素限制紫花苜蓿的生长。因此，提高苜蓿的抗旱和抗盐能力具有重要的意义[1-2]。我国牧草育种起步较晚，种质资源匮乏，迫切需要具有优良农艺性状的种质材料。通过诱变育种技术能诱发大量有利用价值的突变基因，产生一般常规方法难以获得的牧草新类型和特殊性状[3]，培育出更多优异的苜蓿，为牧草育种提供宝贵的材料。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试苜蓿种子为龙牧801和图牧2号，均由黑龙江省畜牧研究所提供，对2种苜蓿种子进行无菌苗培养和茎段的愈伤组织诱导，胁迫和诱变处理。苜蓿愈伤组织的材料编号见表1。

1.2 方 法

1.2.1 苜蓿愈伤组织的诱导和继代培养

挑选籽粒饱满的2种苜蓿种子,0.1%的升汞溶液消毒 10 min ,无菌水冲洗 3～4次,植入 1/2 MS 基本培养基中,于(23±2)℃的条件下培养,培养1～2周后即可得到无菌幼苗。切取其幼嫩茎段0.4～0.6 cm接种于愈伤组织诱导培养基中(MS+2,4-D 1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+30 g蔗糖+8.5 g琼脂，pH=5.8)，于(23±2)℃的条件下培养,培养20 d 左右即可得到愈伤组织，将愈伤组织切割成0.4～0.6 cm3小块，转接到继代培养基中(同诱导培养基)即可获得A 1和A 2类型苜蓿愈伤组织。

1.2.2 愈伤组织NaN3诱变

将2种苜蓿愈伤组织分别置于含有NaN3半致死浓度为4.0×10-3mol/L(用pH=7.0，0.2 mol/L磷酸缓冲液配制)的处理液中，置于恒温摇床中(110 r/min，25 ℃)，震荡4 h后用无菌水冲洗3～5次，用无菌滤纸将愈伤组织表面水分吸干，再将愈伤组织转接到继代培养基，在25 ℃恒温培养箱中培养25 d。龙牧801和图牧2号苜蓿愈伤组织在NaN3的半致死浓度的培养基中进行诱变处理，即可获得D 1和D 2苜蓿愈伤组织。

1.2.3 苜蓿愈伤组织旱和盐胁迫

将愈伤组织置于1.5% NaCl培养基中(成分同前)进行胁迫处理8 d，对存活的愈伤组织继代培养即可获得B 1和B 2类型苜蓿愈伤组织。将愈伤组织置于25% PEG(PEG-6000)液体培养基中(成分同前)进行胁迫处理6 d，对存活的愈伤组织继代培养即可获得C 1和C 2类型苜蓿愈伤组织。

将NaN3诱变处理后生长良好的愈伤组织接种在含2.0% NaCl和30% PEG的致死浓度培养基中，分别胁迫处理12 d和10 d，存活的愈伤组织继代培养基，即可获得E 1、E 2、F 1、F 2类型的愈伤组织。继代培养2～3次后，将2.0% NaCl处理的每种材料中的一部分接入含30% PEG的培养基中进行混合胁迫处理10 d，生长良好的愈伤组织接种到继代培养基中，即可获得G 1和G 2类型的愈伤组织。

1.2.4 生理指标的测定

丙二醛(MDA)含量采取硫代巴比妥酸法，可溶性糖含量采用蒽酮法测定，可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定，游离脯氨酸含量采用茚三酮法测定，相对电导率采用电导率法测定[4-5]。

1.2.5 数据处理与分析

应用隶属法对不同处理的苜蓿愈伤组织的抗逆性进行综合评价。

隶属函数值计算公式：

R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

……(1)

反隶属函数值计算公式：

R(Xi) =1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

……(2)

式中，Xi为指标测定值，Xmin、Xmax为所有实验材料某项指标的最小值和最大值。

将抗性隶属值进行累加求出平均数，公式如下：

X=∑U(Xi) /n

……(3)

在公式(3)中，X是所求平均抗性的隶属值。

2 结果与分析

2.1 NaN3诱变处理苜蓿愈伤组织MDA含量的变化

不同胁迫和诱变处理均使苜蓿愈伤组织的MDA含量下降(见图1)。龙牧801和图牧2号2种苜蓿愈伤组织经PEG胁迫处理与对照组比较(0%PEG、0%NaCl) MDA含量分别下降了33.12%和25.23%，经NaCl胁迫处理，MDA含量分别下降了46.13%和40.48%。

注：A 1、B 1、C 1、D 1、E 1、F 1、G 1为龙牧801的对照、PEG、NaCl、 NaN3、NaN3+PEG、NaN3+ NaCl、NaN3+ NaCl+PEG；A 2、B 2、 C 2、D 2、E 2、F 2、G 2为图牧2号的对照、PEG、NaCl、NaN3、 NaN3+PEG、NaN3+ NaCl、NaN3+ NaCl+PEG。下同。图1 苜蓿愈伤组织MDA含量的变化

经NaN3诱变处理后，降低了2种苜蓿愈伤组织的MDA含量。龙牧801苜蓿愈伤组织的MDA含量在NaN3、NaN3+PEG、NaN3+NaCl、NaN3+PEG+NaCl不同处理组与对照组(0%PEG、0%NaCl)相比分别下降了46.13%、48.84%、52.19%和79.38%；图牧2号苜蓿愈伤组织的MDA含量在NaN3、NaN3+PEG、NaN3+NaCl、NaN3+PEG+NaCl不同处理组与对照组(0%PEG、0%NaCl)相比分别下降了40.48%、43.96%、46.37%和70.54%。

2.2 NaN3诱变处理苜蓿愈伤组织可溶性糖含量的变化

不同胁迫和诱变处理均使苜蓿愈伤组织的可溶性糖含量增加(见图2)。龙牧801和图牧2号2种苜蓿愈伤组织经PEG胁迫处理与对照组比较(0% PEG、0% NaCl)，可溶性糖含量分别增加了45.48%和27.07%，经NaCl胁迫处理，可溶性糖含量分别增加了58.25%和34.27%。

经NaN3诱变处理后，增加了2种苜蓿愈伤组织的可溶性糖含量。龙牧801苜蓿愈伤组织的可溶性糖含量在NaN3、NaN3+PEG、NaN3+NaCl、NaN3+PEG+NaCl不同处理组与对照组(0%PEG、0%NaCl)相比分别增加了74.47%、82.54%、80.73%和86.65%；图牧2号苜蓿愈伤组织的可溶性糖含量NaN3、NaN3+PEG、NaN3+NaCl、NaN3+PEG+NaCl不同处理组与对照组(0%PEG、0%NaCl)相比分别增加了43.79%、73.19%、63.00%和79.28%。

图2 苜蓿愈伤组织可溶性糖含量的变化

2.3 NaN3诱变处理苜蓿愈伤组织相对电导率的变化

不同胁迫和诱变处理均使苜蓿愈伤组织的相对电导率下降(见图3)。龙牧801和图牧2号2种苜蓿愈伤组织经PEG胁迫处理与对照组比较(0% PEG、0% NaCl)，相对电导率分别下降了33.12%和25.23%，经NaCl胁迫处理，相对电导率分别下降了46.13%和40.48%。

图3 NaN3诱变苜蓿愈伤组织相对电导率的变化

经NaN3诱变处理后，降低了2种苜蓿愈伤组织的相对电导率。龙牧801苜蓿愈伤组织的相对电导率在NaN3、NaN3+PEG、NaN3+NaCl、NaN3+PEG+NaCl不同处理组与对照组(0%PEG、0%NaCl)相比分别下降了17.64%、26.65%、31.37%和37.64%；图牧2号苜蓿愈伤组织的相对电导率在NaN3、NaN3+PEG、NaN3+NaCl、NaN3+PEG+NaCl不同处理组与对照组(0%PEG、0%NaCl)相比分别下降了12.82%、20.40%、17.15和39.62%。

表2 5项生理指标隶属函数值

材料处理 可溶性糖 可溶性蛋白 脯氨酸 丙二醛 相对电导率 平均隶属值 龙牧801图牧2号龙牧801图牧2号龙牧801图牧2号龙牧801图牧2号龙牧801图牧2号龙牧801图牧2号对照0．0000．0000．0000．0000．0000．0000．0000．0000．0000．0000．0000．000PEG0．1280．0970．360．0950．3050．2940．4170．3580．1550．0730．2730．183NaCl0．2150．1360．4510．1370．3780．3880．4980．4350．1610．0210．3410．223NaN30．4490．2040．6420．4940．5140．4190．5810．5740．5290．3730．5430．413NaN3+PEG0．7280．7140．8180．6270．7900．6040．6150．6230．7200．5500．7340．624NaN3+NaCl0．6450．4450．9430．7610．7870．8510．6570．6570．8200．4740．7710．638NaN3+NaCl+PEG1．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．000

2.4 NaN3诱变处理苜蓿愈伤组织可溶性蛋白含量的变化

不同胁迫和诱变处理均使苜蓿愈伤组织的可溶性蛋白含量增加(见图4)。龙牧801和图牧2号2种苜蓿愈伤组织经PEG胁迫处理与对照组比较(0%PEG、0%NaCl)，可溶性蛋白含量分别增加了29.69%和10.43%，经NaCl胁迫处理，可溶性蛋白含量分别增加了36.61%、14.38%。

图4 NaN3诱变苜蓿愈伤组织可溶性蛋白含量的变化

经NaN3诱变处理后，增加了2种苜蓿愈伤组织的可溶性蛋白含量。龙牧801苜蓿愈伤组织的可溶性蛋白含量在NaN3、NaN3+PEG、NaN3+NaCl、NaN3+PEG+NaCl不同处理组与对照组(0%PEG、0%NaCl)相比分别增加了42.93%、48.96%、52.52%和53.97%；图牧2号苜蓿愈伤组织的可溶性蛋白含量在NaN3、NaN3+PEG、NaN3+NaCl、NaN3+PEG+NaCl不同处理组与对照组(0%PEG、0%NaCl)相比分别增加了37.73%、43.44%、48.24%和55.06%。

2.5 NaN3诱变处理苜蓿愈伤组织脯氨酸含量的变化

不同胁迫和诱变处理均使苜蓿愈伤组织的脯氨酸含量增加(见图5)。经PEG、NaCl胁迫处理使龙牧801和图牧2号苜蓿愈伤组织脯氨酸含量均上升，分别上升44.14%、49.42%、29.52%、35.64%。经NaN3处理使龙牧801和图牧2号苜蓿愈伤组织脯氨酸含量均上升，分别上升57.05%、37.41%。经NaN3+PEG、NaN3+NaCl、NaN3+PEG+NaCl胁迫处理使龙牧801和图牧2号苜蓿愈伤组织脯氨酸含量均上升，分别上升23.49%、23.27%、35.05%、14.15%、27.83%、34.13%。

图5 NaN3诱变苜蓿愈伤组织脯氨酸含量的变化

2.6 抗逆性综合分析

可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、电导率和丙二醛含量5项生理指标的隶属值如表2所示，隶属函数的综合分析可知，NaN3诱变提高了2种苜蓿愈伤组织的抗旱和抗盐能力，龙牧801和图牧2号抗旱和盐顺序由强到弱依次为：NaN3+NaCl+PEG>NaN3+NaCl>NaN3+PEG>紫外线，隶属函数值综合评价值越大，表明NaN3对苜蓿愈伤组织干旱和盐碱的生理的影响就越大，则其抗旱和耐盐性越强。

3 讨 论

植物组织培养过程中存在着广泛的变异,若用诱变剂处理则可大大提高变异发生的频率[6]，试验中所用诱变剂为NaN3的半致死浓度，采用悬浮处理的方法较易使诱变剂渗入组织细胞。再加上一定的PEG，

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NaCl和PEG与NaCl交替混合处理，增加了苜蓿愈伤组织突变体选择的定向性。

干旱和盐碱逆境对植物造成的伤害主要是渗透胁迫和离子胁迫。在渗透胁迫下,植物通过渗透调节来适应环境变化,主要是指细胞中合成和积累的有活性并且无毒害作用的溶质的过程，这些物质包括无机离子和有机物。在逆境胁迫下,植物体内会通过合成或降解更多的可溶性糖、蛋白质和脯氨酸来提高细胞内溶质浓度,进而增加细胞的渗透势并提高植物对逆境的适应性[7-8]。从可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸的含量来看，这3项指标变化情况基本一致，在PEG、NaCl和NaN3诱变胁迫下苜蓿愈伤组织中3种指标均呈现上升趋势，说明一定的诱变和胁迫可以增强可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖含量，以提高机体的抵抗能力，这与李红等[9]、马玉涵等[10]研究结果一致。

干旱和盐胁迫对植物最明显的伤害之一就是质膜结构及生理功能的破坏，质膜受到损伤引起质膜透性增大，丙二醛是膜脂过氧化作用的终产物之一，其含量可反映植物遭受境伤害的程度。实验发现，NaN3诱变后的苜蓿愈伤组织的相对电导率和丙二醛的含量均呈下降趋势，说明一定的NaN3诱变通过降低相对电导率和丙二醛的含量来减少对苜蓿愈伤组织对逆境的伤害，增加其抗逆性。因此，期望利用NaN3的高效诱变效应，通过对苜蓿愈伤组织的诱变效应的研究，为苜蓿生物学研究和育种提供资源材料。

[1]He S B,Liu G L,Yang H M.Water use efficiency by alfalfa:mechanisms involvinganti-oxidation and osmotic adjustment under drought[J].Russian Journal of Plant Physiology,2012,59(3):348-355.

[2]An Y,Zhou P,Liang J F.Effects of exogenous application of abscisic acidon membrane stabillity,osmotic adjustment,photosynthesis and hormonal status of two lucerne (Medicago satival.) genotypes under high temperature stress ang drought stress[J].Crop and Pasture Science,2014,65(3):274-286.

[3]罗静,周厚成.园艺植物化学诱变与抗性突变体筛选研究进展[J].园艺园林科学,2005,21(8):302-305.

[4]刘建新,王鑫,王凤琴.水分胁迫对苜蓿幼苗渗透调节物质积累和保护酶活性的影响[J].草业科学,2005,22(3):18-21.

[5]杨颖丽,张菁,杨帆，等.盐胁迫对两种小麦渗透性调节物及脯氨酸代谢的影响[J].西北师范大学学报,2013,49(1):72-77.

[6]王瑾,刘桂茄,杨学举.EMS诱变小麦愈伤组织选择抗旱突变体的研究[J].中国农学通报,2005,21(12):190-193.

[7]覃鹏,刘叶菊,刘飞虎.干旱胁迫对烟草叶片丙二醛含量和细胞膜透性的影响[J].亚热带植物科学,2005,33(4):8-10.

[8]张兰,孙建设,刘国荣,等.NaN3在苹果砧木组培苗诱变耐盐筛选中的应用[J].河北农业大学学报,2002,25 (S 1):900-902.

[9]李红,李波,赵洪波,等.诱变处理苜蓿愈伤组织抗碱性的研究[J].草业科学,2009,26(7):32-35.

[10]马玉涵,赵岩,张强,等.叠氮化钠诱变对离体蝴蝶兰类原球茎生理的影响[J].核农学报,2010,24(2):411-414.

(本栏目责任编辑：周介雄)

Response of Physiology to Drought and Salt Tolerance of Alfalfa Callus by NaN3Mutation

LIBo，MAHe

(College of Agriculture，Forestry and Life Sciences，Qiqihar University，Qiqihar Heilongjiang 161006，China)

Experiment the method of plant tissue culture and NaN3mutagenesis were adopted to induced and treated with hybrid stress of NaCl and PEG the two kinds of alfalfa callus,Alfalfa callus five changes of physiological indexes were determined under NaN3mutagenesis.The results showed that with the increase of ultraviolet mutagenesis and stress alfalfa,callus of soluble sugar,soluble protein and proline content present a rise of change trend,conductivity and malondialdehyde content showed a downward trend.NaN3mutagenesis+hybrid stress dealing with soluble sugar,accumulation of soluble protein and proline was most,conductivity and malondialdehyde content was least.

alfalfa； callus； NaN3； drought and salt stress； physiological index

2017-01-09

黑龙江省应用技术研究与开发计划重大项目(GA 15 B 105-5)；齐齐哈尔市科学技术计划项目(NYGG-201518)。

李 波(1962—)，女，辽宁鞍山人；教授，主要从事细胞生物学的教学和科研工作；E-mail：libo1962@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.08.047

S 551+.7

A

1001-4705(2017)08-0047-05