壳聚糖的改性及纳米粒的制备

宋玉品，陈新新，张红豆

（石家庄学院 化工学院，河北 石家庄 050035）

壳聚糖的改性及纳米粒的制备

宋玉品，陈新新，张红豆

（石家庄学院 化工学院，河北 石家庄 050035）

研究了以3种不同分子量的壳聚糖为原料，对其进行季氨化反应合成3种不同分子量的三甲基壳聚糖，用红外光谱对三甲基壳聚糖进行定性检测，并测定其水溶性.水溶性顺序用分子量表示为70万＞4万＞10万.以分子量为70万的三甲基壳聚糖作为载体材料，三聚磷酸钠作为交联剂，采用离子交联法制备纳米粒.以成球率为指标，通过单因素筛选得到制备纳米粒的最优处方：三甲基壳聚糖浓度为0.4 mg/mL，三聚磷酸钠浓度为0.2 mg/mL，两者的加入体积比为3∶2.

壳聚糖；三甲基壳聚糖；纳米粒

0 引言

生物技术特别是基因工程和发酵工程的日益发展，使得蛋白多肽类药物的生产成本日益降低，临床上已经成为治疗内分泌系统疾病、免疫系统疾病等多种疾病的一线用药.然而其具有稳定性差、半衰期短、吸收差等缺陷，对此类药物的发展造成了很大障碍.已上市的蛋白多肽类药物制剂以注射剂为主.由于使用不便和注射疼痛等缺陷，研究者将目光转向安全、便捷、顺应性好的口服给药系统，但面临巨大挑战：胃肠道的酸碱环境、大量酶存在导致蛋白多肽空间构型改变、肽键断裂而失活；亲脂性差，难以通过细胞膜被动吸收；细胞间隙仅有3-10 Å[1]，只适合小分子药物通过，蛋白多肽类药物难以穿过[1].微粒给药系统使用一定的载体材料将蛋白多肽进行包裹，能有效减少与胃肠道的接触，降低了酸碱环境和酶对蛋白多肽的破坏.同时微粒给药系统一般能够在小肠的Peyer’s区吸收[2]，提高蛋白多肽类药物的生物利用度.因此，寻找恰当的载体材料，建立微粒给药系统，是开发蛋白多肽类药物口服制剂的有效途径.

理想的药物载体应该具备低成本、水溶性好、低毒性、非免疫原性、良好的理化性质等特点[3].壳聚糖（CS）是数量仅次于纤维素的一种天然高分子化合物，由甲壳素在高温强碱条件下脱乙酰基得到，具备很多优良的生物学和制剂学性质：细胞相容性好，可生物降解，毒性低；具有粘膜粘附性，增加药物在胃肠道的滞留时间；能可逆地打开细胞旁路，促进亲水性大分子物质的吸收；易于同亲电性基团反应进行化学修饰；可以和带负电的小分子或蛋白多肽在温和、无有机试剂参与的条件下交联构建微粒给药系统，而不影响其生物学活性.因此，在口服给药系统中得到了广泛应用.由于壳聚糖在肠道生理条件下溶解性差，氨基不能质子化，限制了其吸收促进作用的发挥.三甲基壳聚糖（TMC）是壳聚糖的季氨化衍生物，能够在中性及碱性溶液中溶解.TMC具有与壳聚糖类似的生物学性质，打开细胞旁路的能力增加，且未引起细胞膜损伤[4].因此，TMC成为构建口服主动靶向给药系统的理想载体.

本研究选用3种不同分子量的壳聚糖进行季氨化反应，合成3种不同分子量的TMC，以增加其水溶性.测定三甲基壳聚糖的水溶性，选出水溶性最大的TMC作为纳米粒的载体，三聚磷酸钠（TPP）作为交联剂，采用单离子交联法制备TMC空白纳米粒，通过单因素筛选，选出较优处方，为进一步制备蛋白多肽类药物壳聚糖纳米粒提供依据.

1 实验部分

1.1 仪器试剂

实验使用仪器及设备和原料及试剂分别见表1和表2.

表1 实验使用仪器及设备

表2 实验使用原料及试剂

1.2 实验方法

1.2.1 三甲基壳聚糖的合成

将2 g CS和4.8 g碘化钠溶于80 mL N-甲基-2-吡咯烷酮中，60℃油浴条件下加热，冷凝回流，避光反应60 min.向反应液中加入11 mL浓度为15%的氢氧化钠溶液和11.5 mL碘甲烷。继续避光反应90 min，得到棕色反应液，用乙醇沉淀3次后，离心分离.沉淀用乙醇洗涤，然后溶于40 mL水中，加入250 mL浓度为1 mol/L的盐酸乙醇溶液，以Cl-交换I-，离心分离.沉淀用乙醇浸泡过夜，乙醚洗涤3次，得到白色水溶性粉末，40℃真空干燥.将产物溶于30 mL去离子水中透析3 d，冷冻干燥，得白色海绵状固体即为TMC[5].反应流程见图1.

图1 TMC反应流程

1.2.2 纳米粒的制备

1.2.2.1 储备液的制备

TMC溶液：精密称取制得的不同粘度的TMC（分子量分别为4万、10万、70万）溶于蒸馏水中，获得浓度为2 mg/mL的溶液.

TPP溶液：精密称取适量TPP溶于蒸馏水中，获得浓度为1 mg/mL的溶液.

1.2.2.2 空白纳米粒的制备

量取上述储备液，分别稀释成不同浓度，用磁力搅拌器在500 rpm条件搅拌下，将TPP溶液逐滴缓慢地加入到TMC溶液中，继续搅拌10 min，即得蓝色乳光的胶体溶液.

1.2.3 性质测定

1.2.3.1 红外测定

把经过干燥的样品进行KBr压片法处理，然后分别对CS和TMC进行红外光谱分析，在400-4 000 cm-1范围内测定CS和TMC的红外光谱图[6].

1.2.3.2 水溶性测定

分别精密量取3种不同的TMC各5 mg，置于西林瓶中，缓慢地加入适量蒸馏水，磁力搅拌器搅拌，观察TMC的溶解情况，根据溶解消耗蒸馏水的量对比3种TMC的溶解性.

1.2.4 纳米粒的处方筛选

预实验结果表明，当TMC和TPP浓度在一定范围内制得的纳米粒具有明显的乳光和较好的胶体成型性，且这两种材料的浓度对纳米粒性质影响较大.所以，该部分实验以TMC和TPP的浓度及TMC与TPP加入比例作为考察因素，以纳米粒成球率作为考察指标进行单因素实验，以获得纳米粒的较优处方.将制得的纳米粒的胶体溶液在10 000 rpm条件下离心10 min，分离出纳米粒，烘干，称重，得到纳米粒的重量，计算其成球率.

1.2.4.1 TMC浓度的影响

将上述制备的 TPP储备液稀释成 0.2 mg/mL，TMC储备液依次稀释成0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mg/mL，将 TPP 溶液缓慢滴加到 TMC 溶液中，以 500 rpm 的速度搅拌 10 min，在0.2-1.0 mg/mL范围内考察TMC浓度对纳米粒成球率的影响.

1.2.4.2 TPP浓度的影响

通过上述实验得出成球率最高的TMC浓度，将TMC储备液稀释成相应浓度.TPP储备液依次稀释成0.1，0.15，0.2，0.25，0.3 mg/mL，将TPP溶液缓慢滴加到TMC溶液中，以500 rpm速度搅拌，搅拌时间为10 min.在0.1-0.3 mg/mL范围内考察TPP浓度对纳米粒成球率的影响.

1.2.4.3 TMC与TPP加入比例的影响

通过上述实验，得出成球率较高的TMC和TPP浓度.把TMC和TPP分别稀释到相应浓度，两者按不同加入体积比制备纳米粒，搅拌速度为500 rpm，搅拌时间为10 min.在1∶2-5∶2的范围内考察TMC与TPP加入比例对纳米粒成球率的影响.

2 结果与讨论

2.1 红外测定

对CS和TMC的红外光谱进行分析，测定的IR光谱图如图1所示.通过CS和TMC的IR图谱可知，CS的IR中，在1 595 cm-1处有氨基变形振动峰，而在TMC的IR中，该峰减弱，在2 933 cm-1和1 473 cm-1出现了新吸收峰，分别是CH3伸缩振动峰和N-CH3的变形振动峰，这就表明CS分子中氨基上的部分氢已被甲基所取代.此结果与文献[6]中报道结果一致.

2.2 水溶性测定

3种分子量的CS均难溶于中性和碱性水溶液，改性后得到的3种TMC均能溶于水，水溶性得到改善.3种TMC的溶解性顺序为TMC（70万）＞TMC（4万）＞TMC（10万）.CS引入季铵盐基团，由于季铵盐的位阻大、水合能力强，大大削弱了CS分子间氢键的作用，同时有利于水分子与CS分子中的羟基和氨基形成氢键，另外氨基阳性基团的强水溶性也使得CS衍生物水溶性增加，从而增加了CS衍生物的水溶性[7].TMC分子量越大，生物粘附性越强，制备成纳米粒后在体内停留的时间越长，能更好地发挥缓释作用.TMC溶解性越好，分子在水中的伸展程度越高，包载蛋白药物的能力越强.因此选择分子量70万的TMC制备纳米粒.

2.3 TMC纳米粒制备的单因素筛选

2.3.1 TMC浓度的影响

分别以浓度为 0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mg/mL 的 TMC 溶液，和浓度为 0.2 mg/mL 的 TPP 溶液为材料制备纳米粒得到的成球率结果见表3.以TMC浓度为横坐标，成球率为纵坐标作图见图3.表3中的数据和图3中成球率的变化趋势均表明，在0.2-1.0 mg/mL范围内，随着TMC浓度增加，纳米粒成球率先增加后减小，浓度在0.4 mg/mL时成球率最大.

图2 CS 与 TMC 的红外光谱图.（a1）分子量为 4 万的 CS，（a2）分子量为 4 万的 TMC；（b1）分子量为 10 万的 CS，（b2）分子量为10万的TMC；（c1）分子量为70万的CS，（c2）分子量为70万的TMC

TMC纳米粒的制备方法包括乳化交联法、沉淀法、喷雾干燥法、乳滴聚集法、离子交联法、反向胶束法[7，8].离子交联法是利用TMC中带正电的季氨基与带负电的磷酸根，通过静电作用，在磁力搅拌下形成球形微粒.这种相互作用取决于磷酸根和TMC的电荷密度及分子大小.当TMC浓度为0.4 mg/mL时，季氨基的正电荷与0.2 mg/mL的TPP中磷酸根的负电荷相互作用最强，制得的纳米粒最多.

2.3.2 TPP浓度的影响

分别以浓度为0.1，0.15，0.2，0.25，0.3 mg/mL的TPP溶液和浓度为0.4 mg/mL的TMC溶液为材料制备纳米粒得到的成球率结果见表4.以TPP浓度为横坐标，成球率为纵坐标作图见图4.

表3 TMC浓度对纳米粒成球率的影响（n=3）

图3 TMC浓度对纳米粒成球率的影响

表4中的数据和图4中成球率的变化趋势均表明在0.1-0.3 mg/mL范围内，随着TPP浓度增加，纳米粒成球率先增加后减小，当TPP浓度为0.2 mg/mL时成球率最大.即当TPP浓度为0.2 mg/mL时，磷酸根的负电荷与0.4 mg/mL的TMC中季氨基的正电荷相互作用最强，制得的纳米粒最多.

2.3.3 TMC与TPP比例的影响

以浓度为0.4 mg/mL的TMC和0.2 mg/mL的TPP为材料，采用离子交联法制备纳米粒，两者的加入比例在 1∶2-5∶2 之间变化，考察加入比例对成球率的影响.结果见表5.以加入比例为横坐标，成球率为纵坐标作图见图5.表5中的数据和图5中成球率的变化趋势均表明，TMC与TPP投入体积比在1∶2-5∶2之间，随着比例的增加，纳米粒成球率先增加后减小，当TMC与TPP投入体积比为3∶2时纳米粒成球率最高.即用0.4 mg/mL的TMC溶液和0.2 mg/mL的TPP溶液制备纳米粒，当两者的投入体积比为3∶2，TMC中季氨基的正电荷与TPP中磷酸根的负电荷相互作用最强，制得的纳米粒最多.

表4 TPP浓度对纳米粒成球率的影响

图4 TPP浓度对成球率的影响

表5 TMC与TPP比例对成球率的影响（n=3）

图5 TMC与TPP比例对成球率的影响

3 结论

采用离子交联法利用TMC中带正电的季氨基与TPP中带负电的磷酸根，通过静电作用而形成了纳米粒.获得纳米粒的较优处方是TMC的浓度为0.4 mg/mL，TPP的浓度为0.2 mg/mL，TMC与TPP投入量比例为3∶2.采用此处方成功制得了三甲基壳聚糖纳米粒，为进一步制备载蛋白纳米粒提供了依据.

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[3]Huang Suting，Du Yongzhong，Yuan Hong，et al.Synthesis and Anti-hepatitis B Virus Activity of Acyclovir Conjugated Stearic Acid-chitosan Oligosaccharide Micelle[J].Carbohydrate Polymers，2011，83（4）：1 715-1 722.

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[5]陈浮.载蛋白三甲基壳聚糖纳米粒口服给药系统的研究[D].成都：四川大学，2007.

[6]泥国徽.改性壳聚糖交联微球的合成及其蛋白吸附性能的研究[D].济南：山东大学，2009.

[7]胡小娟.新型低毒性两亲性壳聚糖衍生物的合成及其蛇床子素胶束的研制[D].苏州：苏州大学，2013.

[8]沈巍.壳聚糖改性及在化妆品中的应用研究[D].无锡：江南大学，2007.

The Modification of Chitosan and Preparation of Nanoparticles

SONG Yu-pin,CHEN Xin-xin,ZHANG Hong-dou
(School of Chemical Engineering,Shijiazhuang University,Shijiazhuang,Hebei 050035,China)

In this project,N,N,N-trimethyl(TMC)is synthesized from three kinds of chitosan with different viscosity through quaternization reaction.The obtained TMC is characterized by FTIR.Testing its water solubility,the result shows that 70w＞4w＞10w is indicated by TMC’s molecular weight.Subsequently,TMC nanoparticles are prepared by ionic gelation method with TPP as the cross linking agent,and characterized by the precipitation efficacy.Single factor screening is carried out to study the best prescription composition:the concentration of TMC is 0.4 mg/mL,the concentration of TPP is 0.2 mg/mL,and the proportion of TMC and TPP is 3:2.

chitosan;N,N,N-trimethyl;nanoparticle

R943

A

1673-1972（2017）06-0009-06

2017-07-20

河北省自然科学基金（H2016106034）；石家庄学院化工制药实验教学示范中心本科生科技创新基金（口服艾塞那肽纳米粒的研制）

宋玉品（1986-），女，河北深泽人，讲师，主要从事药物新制剂与新剂型研究.

（责任编辑 王颖莉）