超高效液相色谱-质谱法测定水产品中链霉素的研究

方 益，李佩佩，严忠雍，陈 思，张 帅

(浙江省海洋水产研究所；浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江 舟山 316021)

超高效液相色谱-质谱法测定水产品中链霉素的研究

方 益，李佩佩，严忠雍，陈 思，张 帅

(浙江省海洋水产研究所；浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江 舟山 316021)

建立了水产品中链霉素的高效液相色谱-串联质谱检测方法。水产品样品经三氯乙酸溶液水解提取，固相萃取柱净化，经超高效液相色谱-质谱法测定。通过优化前处理与色谱条件，链霉素在1.0～50ng/mL范围内具有有良好的线性关系，相关系数0.995以上，水产品样品平均回收率在81%～105%之间，相对标准偏差在3.8%～9.5%之间，定量检出限为10.0μg/kg，该方法高效、灵敏、准确，可广泛应用于水产品中链霉素的检测。

超高效液相色谱-质谱法；链霉素；水产品

链霉素(streptomycin，SM)是一种广谱氨基糖苷类抗生素，此类抗生素的抗菌作用强，革兰氏阴性菌对其较为敏感，如沙门氏菌、大肠杆菌、产气杆菌等，属于水产品中常用的抗生素。由于链霉素对人体具有较大的毒副作用，严重时可能造成休克和耳聋等症状[1]，对婴幼儿的神经系统造成严重的伤害[2]。链霉素在水产品养殖过程中会被添加，以达到抗病的目的，但是长期使用会导致链霉素的累积，并通过食物链进入人体，造成极大危害，长期食用带有链霉素的水产品，人体容易产生耐药性。由于一些养殖户违规使用链霉素的兽药来防治水产养殖品的病害，从而导致水产品中链霉素残留被检出，尤其在水产品出口中发生抗生素等药物残留超标，造成了经济损失[3-4]。因此，对于研究快速定量检测水产品中链霉素残留量具有很重要的意义。

但由于链霉素具有较高的水溶性和离子化倾向，容易与蛋白组织等结合，导致回收率较低；同时与链霉素相似的结构较多，色谱分离不理想，分离条件难以摸索等，目前对于水产品中链霉素残留的测定方法研究较少[5-7]。目前，链霉素残留的检测方法主要有酶联免疫法[8]、微生物法[9]、液相色谱法[10]、液相色谱-串联质谱法[11]，但微生物法和酶联免疫法易产生假阳性，一般仅用于市场内快速检测；而液相色谱法检测周期较长，而且灵敏度较低，达不到链霉素残留检测要求；液相色谱-串联质谱法是目前的主流检测方法，均采用普通C18反相色谱柱，流动相中需要添加离子对试剂，容易污染色谱柱和质谱检测器，而且前处理过程复杂，链霉素色谱柱保留效果差，峰型较差。故需建立了一种水产品中链霉素残留超高效液相色谱-串联质谱快速检测方法。

本试验采用三氯乙酸溶液水解提取，固相萃取柱净化，经超高效液相色谱-质谱法测定检测，拟建立水产品中链霉素的快速检测方法，为水产品的质量安全提供参考依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高效液相-质谱联用仪，配有电喷雾电离源(美国Waters公司)；旋涡振荡器(德国IKA公司)；高速离心机(德国Beckman公司)；固相萃取柱(WCX，60 mg /3mL，Waters公司)，24位固相萃取装置(美国Supelco公司)；0.22μm滤膜(上海安谱)。

链霉素(纯度≥98%，德国DR.Ehrensotorfer)；乙酸铵(纯度99%)；乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司)；三氯乙酸溶液(5%，质量分数，称取三氯乙酸25g，溶于475mL水，混匀)，乙酸溶液(2%，体积分数，量取乙酸溶液2mL，用水定容至100mL，混匀)；甲醇溶液(25%，体积分数，取50mL甲醇，用水定容至200mL)。

1.2 试验方法

1.2.1 仪器参数

1.2.1.1 液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC C18柱 2.1μm×50mm，1.7μm；流动相(A)：0.1%甲酸5mM乙酸铵溶液；流动相(B)：乙腈；洗脱程序见表1；流速0.3mL/min，柱温40℃，样品室温度4℃，进样量10μL。

表1 流动相洗脱程序

1.2.1.2 质谱条件参数

离子源：电喷雾离子源，正离子扫描(ESI+)；检测方式：多重反应监测(MRM)；毛细管电压：3.50kV；锥孔电压：50V；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：380℃；脱溶剂气流量：600L/hr；锥孔气流：50 L/hr；碰撞气流量：0.24mL/min；链霉素离子对信息见表2。

表2 离子对信息

*为定量离子对

1.2.2 样品提取

称取称取5.00g(精确到0.01g)样品，置于50mL 离心管中，加入10mL三氯乙酸溶液，超声5min，充分混合振荡旋涡90s，经6000r/min离心10min，取出上清液。残留样品使用10mL三氯乙酸溶液重复提取、离心，合并上清液，用氨水调节pH值至7左右，备用。

1.2.3 样品净化

分别使用3mL乙酸溶液、5mL水活化WCX固相萃取柱，移取提取液上样，依次用5mL水、5 mL甲醇溶液淋洗固相萃取小柱，减压抽干，用3mL乙腈-乙酸溶液(体积比为25：75)洗脱，收集洗脱液，用乙腈定容至3mL，过0.22μm滤膜，待检测。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

由于链霉素的极性较大，在C18等普通反相色谱柱上难以保留，必须采用离子对试剂才能获得较好的保留效果，但是离子对试剂会污染离子源，可能会产生很强的离子抑制，难以去除。故选择水性HILIC色谱柱，水性化合物在HILIC色谱柱具有较好的保留效果，从而避免使用离子对试剂。

2.2 提取方式的选择

链霉素属于热稳定和极性高的化合物，在酸碱环境下稳定，难溶于有机溶剂，但水溶性好，在水产品中可与蛋白质结合。因此能够水解样品组织，沉淀蛋白质，从水产品组织中游离出氯霉素是提取的关键。一般水解组织和沉淀蛋白，通常采用磷酸溶液、三氯乙酸溶液、乙酸铅溶液等沉淀蛋白，本文考察了用磷酸溶液、三氯乙酸溶液、乙酸铅溶液等沉淀蛋白的方法，其中三氯乙酸溶液蛋白沉淀效果好，且回收率及重复性较好。由于三氯乙酸溶液偏酸性，过弱阳离子交换固相萃取柱时，酸性环境会降低链霉素的回收率，所以将提取液的pH调节至7.0左右。

2.3 线性关系、检出限、回收率和精密度

配制链霉素标准物质浓度为1.0，2.0，5.0，10，20，50ng/mL，按照1.2.1进行测定，标准溶液色谱图见图1。以峰响应为y值，各系列梯度浓度为x值绘制曲线。线性方程、相关系数和检出限(S/N =3)见表3。

图1 标准溶液色谱图

Fig.1 Chromatogram of standard solution

选取不含有链霉素的水产品(对虾)，分别添加标准溶液，做6次平行，按照1.2.1、1.2.2、1.2.3进行样品前处理和测定，计算回收率与精密度，结果见表3。

表3 线性方程、相关系数、检出限、回收率和精密度(n=6)

3 结论

本试验建立了超高效液相色谱-质谱法测定水产品中链霉素的方法，水产品样品经三氯乙酸溶液提取，固相萃取柱净化，经超高效液相色谱-质谱法测定检测，前处理步骤摒弃使用离子对试剂，保护仪器，简单方便，提高了检测效率，已应用于实际检测任务中，取得了良好的效果，具有较高的推广价值。

[1] 何 强，孔祥虹，赵 洁，等．奶粉中链霉素与双氢链霉素残留量的超高效液相色谱-串联质谱法测定[J]．分析测试学报，2010，29(7):691-694．

[2] Selimoglu E．Aminoglycoside-induced ototoxicity[J]．Curr Pharm Des，2007，13(1):119 -126．

[3] 高 玲，张 丹，高 峰，等．高效液相色谱-串联质谱法检测蜂蜜和牛奶中的大环内酯类药物残留[J]．中国兽药杂志，2012，46(4):29-33．

[4] 曹 军，陈 勇，杨瑞章，等．分散固相萃取-高效液相色谱/串联质谱法测定水产品中19 种喹诺酮类兽药残留[J]．中国兽药杂志，2011，45(7):35-37．

[5] 钱 疆，余孔捷，陈 健，等．液相荧光法检测乳制品中9种氨基糖苷类药物残留[J]．福建分析测试，2011，20(3):13-17．

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[7] Edder P，Cominoli A，Corvi C．Determination of streptomycin residues in food by solid-phase extraction and liquid chromatography with post-column derivatization and fluorometric detection[J]．J Chromatogr A，1999，830(2):345-351．

[8] 黄耀凌, 刘智宏, 叶 妮, 等. ELISA法检测牛奶中链霉素残留量[J]. 中国乳品工业, 2007,35(2):54-56.

[9] 蔡金华, 刘雅妮,顾 欣．链霉素在牛奶中残留的微生物学检测方法[J]．中国兽药杂志, 2004,38(11):7-9.

[10] 陈晓红, 刘小莉, 董明盛, 等.高效液相色谱法测定蜂产品中链霉素残留量[J]．分析试验室, 2004, 23(10):30-32．

[11] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 22969-2008 奶粉和牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法[S]．北京:中国标准出版社，2009．

(本文文献格式：方益，李佩佩，严忠雍，等.超高效液相色谱-质谱法测定水产品中链霉素的研究[J].山东化工，2017，46(20)：67-69.)

ResearchontheDeterminationofStreptomycininAquaticProductsbyUltra-liquidChromatography-mass

FangYi,LiPeipei,YanZhongyong,ChenSi,ZhangShuai

(Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang; Key lab of Sustainable Utilization of Technology Research for Fishery Resource of Zhejiang, Zhoushan 316021,China)

A ultra-liquid chromatography-mass method was developed for determining aquatic products in aquatic products. Aquatic products samples were extracted directly by acetocaustin solution, solid phase extraction column purification, determination by ultra performance liquid chromatography mass spectrometry. Through the optimization of pretreatment and chromatographic conditions of streptomycin in the range of 1.0～50ng/mL with a good linear relationship, the correlation coefficient is above 0.995, the average recovery rate of water samples was between 81%～105%, the relative standard deviation between 3.8%-9.5%, quantitative detection limit is 10.0g/kg, the method is efficient, sensitive and accurate, and can be widely applied to detecting streptomycin in aquatic products..

ultra-liquid chromatography-mass method; streptomycin; aquatic products

2017-08-16

浙江省科技计划项目(2017C32032)，浙江省科技计划公共服务项目(2016F30022)

方 益(1986—)，浙江舟山人，硕士，主要从事水产品加工与质量安全。

O657.7+2

A

1008-021X(2017)20-0067-03