基于近红外技术柑橘黄龙病田间快速检测方法研究

饶 敏, 桂家祥, 卢占军, 肖青青, 张 岑

(1.江西省赣州出入境检验检疫局, 赣州 341000; 2.国家脐橙工程技术研究中心, 赣州 341000;3. 广东讯动网络科技有限公司, 广州 510000)

基于近红外技术柑橘黄龙病田间快速检测方法研究

饶 敏1, 桂家祥1, 卢占军2, 肖青青3, 张 岑1

(1.江西省赣州出入境检验检疫局, 赣州 341000; 2.国家脐橙工程技术研究中心, 赣州 341000;3. 广东讯动网络科技有限公司, 广州 510000)

柑橘黄龙病在感病植株和健康植株之间传播速度快，因此快速检测柑橘黄龙病对其防治十分关键。本文研究了近红外技术快速检测柑橘黄龙病的方法。采用PLS-LDA建立的模型对未参与建模的样品进行了检测，结果表明，该模型检测的准确率与普通PCR检测的结果符合率达到100%，假阳性率小于1%。该技术具有检测周期短、无污染等优点，可用于田间黄龙病的快速检测。

近红外光谱技术; 柑橘黄龙病; 田间快速检测; PLS-LDA

黄龙病是柑橘生产上最具毁灭性的病害,其防治的有效措施是清除病源,切断传播媒介[1]。简便、准确的田间快速检测技术是目前柑橘黄龙病防控亟须解决的问题。柑橘黄龙病的诊断方法主要有田间症状诊断、指示植物鉴定、PCR生物技术检测(即DNA检测)[2]等。田间症状鉴别简便、直接,一旦柑橘树叶片出现斑驳状黄化,挂果期出现“红鼻子果”,即可断定是黄龙病树;但未表现典型发病症状的植株易与生理黄化相混淆,导致错误诊断。指示植物鉴定周期长,难以用于实际生产;DNA检测虽然准确,但需要在实验室完成,无法满足现场、快速的检测需求。

近红外光是最早发现的不可见光,20世纪90年代以来,以近红外光为基础的光谱分析技术得到较快发展,并广泛应用于农业、石油化工、食品工业、制药工业及临床医学等领域。将近红外光谱(near infrared,NIR)应用于柑橘黄龙病检测也有了一些初步研究[3-9]。最早开展柑橘黄龙病红外光谱检测研究的是美国佛罗里达大学,研究者分别对感染黄龙病的柑橘植株和缺锌、缺锰植株的叶片进行近红外和中红外区光谱扫描分析,发现感染黄龙病的叶片在近红外区具有一定的特征,可用于柑橘黄龙病快速检测[4]。目前对处于潜伏期的黄龙病样品的快速检测方法还没有相关的研究,同时在仪器上缺乏规模化、便携式的近红外光谱仪器。近红外技术在检测黄龙病上具有快速,无损,可重复等优点[10-13],可在实际中为种植户提供指导,具有良好的效果和广阔的应用前景。

本研究在已有研究成果的基础上,就NIR应用于柑橘黄龙病田间快速检测方法进行了深入的算法优化,对黄龙病潜伏期样品进行了近红外检测,同时对开发规模化和便携化的近红外黄龙病专用检测仪进行了研究,并对研究成果进行了验证。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用叶片材料均采自于国家脐橙工程技术研究中心。所采叶片类型包括：有症状,经PCR检测鉴定为感染黄龙病的叶片;经PCR检测感病,但田间未显症的叶片;田间表现缺素症状叶片(主要为缺锌、氮、镁元素),共计1 800个样品。

1.2 仪器设备

光谱仪器采用广州讯动网络有限公司开发的NGD-U1模块,该模块采用最新的MEMS微镜技术原理,波长范围900～1 700 nm,仪器轻便,适宜田间现场检测。

1.3 试验方法

采集叶片近红外光谱:擦干样品叶片,使其干净无污渍,不采集叶脉位置。在同一叶片,通过上述光谱仪正反两面各采集3个点,得到该叶片的反射率。通过化学计量学软件,建立鉴别模型。

2 结果与分析

2.1 光谱信息

感染黄龙病叶片、潜伏期黄龙病叶片以及未感染叶片原始光谱图及二阶导数光谱图如图1、图2。

图1 不同样品叶片原始光谱图Fig.1 Original spectra of different leaves

图2 不同样品叶片二阶导数光谱图Fig.2 Second derivative spectra of different leaves

从图1、图2上可看出,感染与未感染叶片的光谱特征区域主要分布在1 300 ～ 1 500 nm 范围内,潜伏期与已显症叶片光谱图均有明显特征,易于识别。通过采用化学计量学方法[14-16],对近红外数据进行多元散射校正(MSC法),消除叶面散射以及光程变化对NIR漫反射光谱的影响,可以提炼出感染黄龙病的特征信息,进而识别出是否感染。

2.2 方法筛选

NIR 应用于柑橘黄龙病快速检测依据NIR在定性分析中 “相似相聚”的原理,通过不同的模式识别方法将同类样品聚在一起,对不同的样品进行分离,从而对样品的类别进行判定[18-19]。通过化学计量学软件,对样品光谱数据进行主成分聚类分析,得到如下聚类图,如图3。从图3中可以看出,黄龙病样品与未感染样品有明显界线,说明近红外方法检测黄龙病是可行的。

图3 不同样品叶片聚类分析Fig.3 Cluster analysis of different leaves

近红外光谱分析技术的定量定性分析都需建立在化学计量学基础上,为了更好地建立黄龙病判别分析模型,需进行相应的算法优选,本试验挑选目前较常用的集中判别分析算法,K-最近邻域(KNN)、随机森林(random forests)、朴素贝叶斯、集成学习方法和偏最小二乘法-线性判别分析(PLS-LDA)分别建立模型,按6次随机样品分类,识别率结果见表1。将收集到的样品划分为建模集和检验样品集。建模集用于确定近红外定量模型的参数,然后采用不参与建模过程的检验样品集对优选的模型进行检验。根据模型的可用性来评价模型预测未知样品的能力,本研究采用的评价指标为识别率(recognition rate)。识别率(%)=预测准确的样品个数/总样品数×100,识别率越大,说明模型的性能越好。

表1不同分析方法的识别率

Table1Recognitionrateofdifferentanalyticalmethods

随机次数Randomtimes识别率/% AccuracyK邻近算法KNN随机森林法Randomforests朴素贝叶斯Naivebayes集成学习方法Ensemblelearningmethods偏最小二乘线性判别分析PLS⁃LDA198．4293．1664．7492．11100．00299．4793．1661．0592．1199．47398．4297．8970．5393．1699．47497．8994．2166．8491．5899．47597．8990．0069．4785．79100．006100．0092．1165．7986．8499．47

表1显示,5个定性分析算法中PLS-LDA的准确率和稳定性最好,所以本研究选择该方法作为柑橘黄龙病检测的建模方法,并以此为基础进行模型优化、完善和验证。

不同的预处理方法对光谱信息的提取会有不同,本研究对比了归一化、标准化、标准正态分布(SNV)、多元散射校正(MSC)、SG一阶导数、SG二阶导数等六种方法预处理后的建模差异,其识别率结果见下表2。

表2不同预处理方法的识别率

Table2Recognitionrateofdifferentpretreatmentmethods

预处理方法Pretreatmentmethod项目Item主因子数Principalfactor黄龙病识别率/%RecognitionrateofHLB未感染叶片识别率/%Recognitionrateofuninfectedleaves总识别率/%Totalrecognitionrate原始光谱Originalspectrum模型Model检验Test2099．899．799．799．080．089．5归一化Normalization模型Model检验Test1999．899．699．7100．084．092．0标准化Standardization模型Model检验Test1999．899．799．783．079．081．0标准正态分布SNV模型Model检验Test2099．999．599．799．087．093．0多元散射校正MSC模型Model检验Test2099．899．699．799．091．095．0SG一阶导数Firstderivative模型Model检验Test2099．999．799．887．063．075．0SG二阶导数Secondderivative模型Model检验Test2099．399．299．281．063．072．0

表2显示,6个预处理方法中MSC法的识别率最好,MSC具有消除叶面散射以及光程变化对NIR漫反射光谱的影响,所以本研究选择该预处理方法,并以此为基础进行模型优化、完善和验证。

2.3 模型应用

为提高PLS-LDA模型的准确率,对建模的预处理方法和建模波段进行了优化,采用优化后的模型对720个未参与建模的样品(包括传统PCR检测方法判定为黄龙病的样品340个,未感染黄龙病样品380个)进行判定,结果(表3,图4)表明,经近红外方法预测判定黄龙病结果准确识别率达到100%,假阳性率小于1%。通过上述方法建立的柑橘黄龙病检测模型在黄龙病快速检测系统中只需10 s就能得到检测结果,并且该方法对潜伏期黄龙病检测有效,大大减少了人为误判的可能性。试验验证了近红外光谱法与经典检测方法结果无显著差异,并初步通过实践应用证明其在田间快速检测上的可行性和实用性。

表3PLS-LDA模型预测黄龙病识别率
Table3RecognitionratesofHuanglongdiseasebyPLS-DLAmodel

样品类别TypePCR鉴定结果/个ResultofPCRPLS⁃LDA鉴定结果/个ResultofPLS⁃LDA识别率/%Recognitionrate感染黄龙病叶片LeaveinfectedbyHuanglongdisease340340100未感染叶片Uninfectedleave38037999．7388

图4 优化模型对样品的判定结果Fig.4 Results of the optimization model for the samples

3 结论与讨论

NIR技术是一种快速、无污染的新型快速检测技术,本研究表明,通过优选预处理、建模算法能将黄龙病快速检测模型判定柑橘黄龙病阳性与普通PCR阳性的符合率提升至100%,近红外预测值与传统PCR检测技术方法的检测结果无显著差异。便携式近红外光谱仪结合化学计量学PLS-LDA算法,能够逐步地应用于柑橘黄龙病田间快速检测,从而对柑橘黄龙病的整个生产过程进行全程检测和监控,该技术具有很大的发展空间和推广前景。

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(责任编辑： 杨明丽)

FastdeterminationofHuanglongbingdiseaseinthefieldbynearinfraredspectroscopy

Rao Min1, Gui Jiaxiang1, Lu Zhanjun2, Xiao Qingqing3, Zhang Cen1

(1.GanzhouEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Jiangxi341000,China; 2.NationalNavelOrangeEngineeringResearchCenter,Ganzhou341000,China; 3.GuangdongXundongScienceandTechnologyLtd.,Guangzhou510000,China)

It is very important to develop rapid detection method for Huanglongbing (HLB) disease, because of the rapid spread of the disease. In this paper, the near infrared technique was applied for rapid detection of HLB. The model of PLS-LDA was used to detect the samples which did not participate in the modeling. The accurate rate of this technique was 100% same with that of PCR, and the false positive rate was less than 1%. Field detection showed that the near infrared technique for HLB rapid detection is feasible and practical, and can be used in the field detection of HLB disease, with the advantages of short detection cycle, no pollution, etc.

near infrared spectroscopy; citrus Huanglongbing disease; rapid detection in the field; PLS-LDA

2017-02-23

2017-05-23

江西省科技计划项目(20152ACF60003,20151BBG70067,20141BBF60053);江西省科研院所基础设施项目(20151BBA13045);国家自然科学基金(31560602)

联系方式 E-mail:gzrm@qq.com

S 436.66

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.022